李小陽，宮源，裴紋萱，董玲，孫裕，宋學(xué)斌，陳建波*，王晶娟*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.黑龍江省肇東市第一中學(xué)，黑龍江 肇東 151100；3.北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029；4.蘭州佛慈制藥股份有限公司，甘肅 蘭州 730046)

中藥當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根，性溫，味甘、辛，歸肝、心、脾經(jīng)，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)腸通便之功效[1]。作為傳統(tǒng)的藥食兩用品種，當(dāng)歸產(chǎn)銷量大，價(jià)格較高，而且經(jīng)常出現(xiàn)熏硫加工、摻假混偽、以次充好等問題。因此，建立當(dāng)歸全程質(zhì)量控制方法，對(duì)于保證當(dāng)歸在藥用或者食用時(shí)的有效性和安全性是非常必要的。

根據(jù)現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典》(《中國(guó)藥典》)規(guī)定，當(dāng)歸的鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)主要分為形性指標(biāo)和化學(xué)指標(biāo)兩部分。其中，形性指標(biāo)包括性狀、切片和粉末顯微結(jié)構(gòu)，化學(xué)指標(biāo)包括對(duì)照藥材、阿魏酸、藁本內(nèi)酯定性檢測(cè)(薄層色譜)、揮發(fā)油含量測(cè)定、阿魏酸含量測(cè)定[1]。形性指標(biāo)的檢查過程相對(duì)簡(jiǎn)便、快速，但是這些方法比較依賴于操作者的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，主觀因素影響較大，難以嚴(yán)格規(guī)范?；瘜W(xué)指標(biāo)相對(duì)客觀、量化，容易規(guī)范，但是檢查過程需要的時(shí)間和成本也較高。而且，現(xiàn)有的薄層色譜、液相色譜和揮發(fā)油測(cè)定只能反映當(dāng)歸的部分化學(xué)成分信息，對(duì)于很多其他成分缺少控制。因此，建立一種客觀、量化、簡(jiǎn)便、快速的整體成分檢測(cè)方法，作為現(xiàn)有形性指標(biāo)和化學(xué)指標(biāo)的補(bǔ)充，既可以更加全面地對(duì)當(dāng)歸質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，又可以提供高通量、低成本的快速檢測(cè)手段，對(duì)于實(shí)現(xiàn)當(dāng)歸的全程質(zhì)量控制是非常有意義的。

大量研究表明，紅外光譜可以作為一種有效的中藥整體化學(xué)成分快速檢測(cè)方法[2-9]。紅外光譜測(cè)試對(duì)樣品的前處理要求非常簡(jiǎn)單，絕大部分中藥樣品可以直接或者粉碎后進(jìn)行測(cè)試，不需要使用有機(jī)溶劑進(jìn)行分離提取。因此，紅外光譜作為指紋圖譜能夠全面反映中藥樣品整體化學(xué)成分，而且具有簡(jiǎn)便快速、綠色低廉的優(yōu)勢(shì)。已有報(bào)道表明，使用紅外光譜對(duì)當(dāng)歸的化學(xué)成分進(jìn)行表征、對(duì)當(dāng)歸及其相似物種進(jìn)行區(qū)分是可能的[10-14]。因此，本研究擬通過建立當(dāng)歸藥材的紅外光譜指紋圖譜及其相似度評(píng)價(jià)指標(biāo)，提供一種簡(jiǎn)便、客觀、量化、反映整體成分信息的當(dāng)歸質(zhì)量快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

當(dāng)歸藥材分別于2015年和2016年采集自甘肅岷縣(19批次)、渭源縣(20批次)和漳縣(20批次)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院王晶娟副教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根。兩個(gè)熏硫當(dāng)歸樣品來自藥材市場(chǎng)。川芎、獨(dú)活、羌活、前胡為購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院的對(duì)照藥材。中藥樣品粉碎后過60目篩，粉末直接進(jìn)行紅外光譜測(cè)試。分析純蔗糖和溴化鉀(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 紅外光譜測(cè)試

紅外光譜測(cè)試所用儀器為PerkinElmer Spectrum One傅里葉變換紅外光譜儀，DTGS檢測(cè)器，溴化鉀壓片法獲得樣品粉末的透射紅外光譜。光譜測(cè)量范圍4000400 cm-1，分辨率4 cm-1，每張光譜累加掃描16次，使用空氣作為光譜背景，掃描過程中自動(dòng)扣除水蒸氣和二氧化碳干擾。

1.3 數(shù)據(jù)處理

樣品原始測(cè)量光譜經(jīng)過PerkinElmer Spectrum v10軟件的自動(dòng)基線校正和歸一化處理后進(jìn)行譜圖分析。使用MATLAB v7.0軟件計(jì)算樣品紅外光譜的相關(guān)系數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。紅外光譜的相關(guān)系數(shù)使用ASTM規(guī)定的夾角余弦方程式(1)定義[15]，即：

(1)

式中：Rij為光譜i與光譜j之間的相關(guān)系數(shù)，xik與xjk分別是光譜i與光譜j在波數(shù)k處的吸光度，n是所選擇光譜區(qū)域內(nèi)波數(shù)變量數(shù)目。

2 結(jié)果與討論

2.1 當(dāng)歸藥材紅外光譜整體特征分析

圖1所示為甘肅岷縣、渭源縣和漳縣所產(chǎn)不同批次當(dāng)歸藥材的平均紅外光譜。3個(gè)產(chǎn)地的當(dāng)歸藥材紅外光譜特征比較一致，主要包括：3600～3000 cm-1區(qū)域的羥基O-H伸縮振動(dòng)吸收峰、3000～2800 cm-1區(qū)域的C-H伸縮振動(dòng)吸收峰、1750 cm-1附近的羰基C=O伸縮振動(dòng)吸收峰、1640 cm-1附近的復(fù)雜疊加峰(蛋白質(zhì)酰胺I帶、羥基O-H彎曲振動(dòng)吸收峰、芳環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰等)、1300～900 cm-1區(qū)域的復(fù)雜疊加峰(C-O伸縮振動(dòng)峰、O-H彎曲振動(dòng)峰、糖環(huán)骨架振動(dòng)峰等)?？梢钥吹剑?800～1400 cm-1區(qū)域，當(dāng)歸藥材紅外光譜與結(jié)晶態(tài)蔗糖非常相似，說明當(dāng)歸藥材中含有大量的結(jié)晶態(tài)蔗糖。

注：a.岷縣當(dāng)歸平均光譜；b.漳縣當(dāng)歸平均光譜；c.渭源縣當(dāng)歸平均光譜；d.蔗糖。圖1 不同產(chǎn)地當(dāng)歸平均紅外光譜

2.2 當(dāng)歸藥材對(duì)照光譜與相關(guān)系數(shù)閾值計(jì)算

性狀鑒定中發(fā)現(xiàn)，2016年漳縣所產(chǎn)當(dāng)歸中有3個(gè)批次的樣品異常，全歸整體細(xì)小，表面黑棕色，質(zhì)地硬。后續(xù)紅外光譜分析也發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)批次的當(dāng)歸樣品與其他樣品有顯著差異，因此將其標(biāo)記為異常當(dāng)歸樣品。其余56批次的當(dāng)歸樣品沒有顯著的性狀或者光譜異常，均作為校正集樣品使用。

鑒于中藥材天然存在的成分波動(dòng)性，將全部校正集當(dāng)歸樣品的平均光譜作為當(dāng)歸藥材對(duì)照光譜。然后，逐個(gè)計(jì)算校正集樣品光譜與對(duì)照光譜的相關(guān)系數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到顯著性水平為0.05時(shí)的相關(guān)系數(shù)分布下限，即為正常當(dāng)歸藥材的相關(guān)系數(shù)識(shí)別閾值。如果待測(cè)樣本與當(dāng)歸對(duì)照光譜的相關(guān)系數(shù)高于識(shí)別閾值，則認(rèn)為該待測(cè)樣本是正常當(dāng)歸藥材；反之，認(rèn)為該待測(cè)樣本不是當(dāng)歸或者是異常當(dāng)歸藥材。需要注意的是，光譜相關(guān)系數(shù)的最大值是1、最小值是0，因此對(duì)相關(guān)系數(shù)分布區(qū)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，應(yīng)該使用beta分布函數(shù)進(jìn)行擬合。見圖2。

注：A.1800～800 cm-1；B. 1800～1200 cm-1； C.1200～800 cm-1。圖2 不同波段校正集當(dāng)歸樣本紅外光譜相似度分析

注：A.1800～800 cm-1；B. 1800～1200 cm-1；C.1200～800 cm-1。圖3 不同波段相關(guān)系數(shù)閥值

由于紅外光譜的不同波段所反映的化學(xué)成分信息具有一定差異，建立中藥材的紅外光譜指紋圖譜與相似度評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)需要選擇合適的光譜區(qū)域。原則上，作為指紋圖譜所使用的光譜區(qū)域應(yīng)該盡可能寬，以覆蓋盡可能多的化學(xué)信息。但是，有些光譜區(qū)域?qū)τ跇悠纷R(shí)別沒有顯著意義甚至引入干擾，應(yīng)該予以排除。對(duì)于大部分中藥材來說，1800～800 cm-1區(qū)域的紅外光譜基本可以滿足作為指紋圖譜的需求。如果需要特別關(guān)注某部分化學(xué)信息，可以將光譜區(qū)域進(jìn)一步縮小或進(jìn)行組合。對(duì)于當(dāng)歸藥材來說，1800～800 cm-1區(qū)域反映了整體化學(xué)信息，1200～800 cm-1區(qū)域主要反映了蔗糖信息，而1800～1200 cm-1區(qū)域主要反映了蔗糖以外的其他成分信息。因此，本研究選擇上述3個(gè)波段分別建立當(dāng)歸藥材的相關(guān)系數(shù)識(shí)別閾值(結(jié)果如圖3所示)，所有波段的相似度同時(shí)滿足要求才認(rèn)為是正常的當(dāng)歸藥材，以提高當(dāng)歸藥材紅外光譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)方法的特異性。使用上述3個(gè)波段的相關(guān)系數(shù)識(shí)別閾值對(duì)校正集樣品進(jìn)行檢查，所有樣品均正常，說明該方法具有很好的靈敏度。

2.3 異常當(dāng)歸樣品的識(shí)別與分析

如圖4所示，上面建立的多波段當(dāng)歸藥材紅外光譜指紋圖譜相似度指標(biāo)，可以有效識(shí)別出異常當(dāng)歸藥材與傘形科其他藥材。需要注意的是，僅使用1800～800 cm-1區(qū)域的紅外光譜，無法發(fā)現(xiàn)熏硫當(dāng)歸、川芎、獨(dú)活與正常當(dāng)歸藥材的差異；僅使用1200～800 cm-1區(qū)域的紅外光譜，無法發(fā)現(xiàn)部分熏硫當(dāng)歸、川芎與正常當(dāng)歸藥材的差異。這說明，使用多個(gè)波段建立當(dāng)歸藥材紅外光譜指紋圖譜相似度指標(biāo)，確實(shí)可以有效提高該評(píng)價(jià)方法的特異性。

注：A.1800～800 cm-1；B.1800～1200 cm-1；C.1200～800 cm-1。圖4 不同波段異常當(dāng)歸樣本紅外光譜相似度分析

圖5所示為當(dāng)歸藥材對(duì)照紅外光譜與2016年漳縣所產(chǎn)3個(gè)批次異常當(dāng)歸樣品的紅外光譜。相比于對(duì)照光譜，異常當(dāng)歸樣品的主要差異在于1200～800 cm-1區(qū)域的吸收峰強(qiáng)度下降，而且吸收峰形狀明顯不同，說明其中結(jié)晶態(tài)蔗糖含量較少。這些異常樣品可能是生長(zhǎng)發(fā)育不良，或者遭受了某些外界傷害，導(dǎo)致糖類成分積累異常。

注：A.當(dāng)歸對(duì)照光譜；B.異常當(dāng)歸樣本1；C.異常當(dāng)歸樣本2；D.異常當(dāng)歸樣本3。圖5 異常當(dāng)歸樣本紅外光譜分析

圖6所示為當(dāng)歸藥材對(duì)照紅外光譜與兩個(gè)熏硫樣本的吸收峰形狀，與當(dāng)歸藥材相比，熏硫樣本在1200～800 cm-1區(qū)域的吸收峰形狀也有所改變，說明硫熏對(duì)當(dāng)歸藥材的成分影響比較明顯。

注：A.當(dāng)歸對(duì)照光譜；B.硫熏當(dāng)歸樣本1；C.硫熏當(dāng)歸樣本2。圖6 硫熏當(dāng)歸樣本紅外光譜分析

圖7所示為當(dāng)歸藥材對(duì)照紅外光譜與同科其他4種根類藥材的紅外光譜。從1200～800 cm-1區(qū)域的吸收峰形狀看，傘形科根類藥材中普遍含有蔗糖，說明這些藥材的原植物具有相似的糖類成分代謝和積累途徑，但是當(dāng)歸中蔗糖相對(duì)含量最高，羌活和前胡中蔗糖相對(duì)含量較低。川芎、獨(dú)活、羌活、前胡這4種藥材與當(dāng)歸的主要差異還是在1800～1200 cm-1區(qū)域，例如1740 cm-1附近的羰基伸縮振動(dòng)峰。

注：A.當(dāng)歸對(duì)照光譜；B.川芎；C.獨(dú)活；D.羌活；E.前胡。圖7 當(dāng)歸相似藥材紅外光譜分析

3 結(jié)論

使用多波段紅外光譜指紋圖譜相似度指標(biāo)，可以對(duì)當(dāng)歸藥材的質(zhì)量進(jìn)行客觀量化的評(píng)價(jià)，為當(dāng)歸的全程質(zhì)量控制提供一種高通量、低成本的快速檢測(cè)方法。紅外光譜用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的最根本優(yōu)勢(shì)在于直接無損：一方面，紅外光譜是化合物的指紋圖譜，不需要進(jìn)行衍生化等分子標(biāo)記處理，根據(jù)待測(cè)樣品的光譜特征即可直接對(duì)其成分進(jìn)行分析；另一方面，各種形態(tài)的樣品都可以直接進(jìn)行紅外光譜測(cè)試，不需要進(jìn)行分離提取等預(yù)處理。因此，使用紅外光譜技術(shù)可以顯著地節(jié)省檢測(cè)過程的人力、物力、時(shí)間、化學(xué)品消耗，而且能夠反映不同類型化學(xué)成分的整體信息。但是，中藥樣品不經(jīng)分離提取而直接進(jìn)行紅外光譜測(cè)試時(shí)，樣品中各種成分的吸收信號(hào)疊加在一起，相似成分信號(hào)重疊難以區(qū)分，弱吸收信號(hào)被強(qiáng)吸收信號(hào)所掩蓋，難以找出微量成分的特征信號(hào)。因此，在使用紅外光譜對(duì)中藥樣品質(zhì)量進(jìn)行初步篩查的基礎(chǔ)上，還應(yīng)該使用色譜、質(zhì)譜等方法對(duì)特定成分進(jìn)行更加精確的定性定量檢測(cè)，才能夠?qū)χ兴帢悠愤M(jìn)行比較完善可靠的質(zhì)量評(píng)價(jià)。