朱 超，王慧琴，孫斯蔚，張文婷，丁 澤

(陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

0 引言

乙烯基類聚合物是由含碳碳雙鍵的單體經(jīng)自由基聚合反應(yīng)所得，由于具有良好的水分散性，能與膠原分子發(fā)生交聯(lián)結(jié)合形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并且其官能團可與膠原反應(yīng)而使結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[1]，故一直以來乙烯基類聚合物倍受皮革化學(xué)工作者的青睞[2].然而在其廣泛應(yīng)用的同時，由于未充分利用及處理不當(dāng)，導(dǎo)致部分乙烯基類聚合物隨工業(yè)廢水進入水體環(huán)境中，很可能對水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能造成影響.污水處理廠的活性污泥生化系統(tǒng)作為這類聚合物進入環(huán)境的第一道防線，是強化了的水體功能微生物集群，研究乙烯基類聚合物對其中模式種群的生物學(xué)效應(yīng)及毒理學(xué)機制對于評價基于乙烯基類聚合物的各類制革化學(xué)品的生態(tài)風(fēng)險和環(huán)境友好性具有重要意義.

近年來的研究表明變形菌門[3,4]和厚壁菌門[3-5]是活性污泥系統(tǒng)中參與有機物降解的優(yōu)勢種群.芽孢桿菌屬是厚壁菌門中典型的孢子生成菌屬[6]，其催化途徑受葡萄糖和各種快速代謝底物的催化代謝物所抑制，其休眠態(tài)細胞較之營養(yǎng)細胞有更強的環(huán)境壓力抵抗能力.克雷伯氏菌屬[7]屬于變形菌門，其廣泛分布于土壤、植被和水體等環(huán)境中，參與各類生物和地球化學(xué)反應(yīng)，是非臨床脅迫環(huán)境中的主要微生物構(gòu)成種群.許多克雷伯氏菌屬成員都具備參與環(huán)境生物修復(fù)的特性.從多環(huán)芳烴-重金屬土壤中分離純化得到的一株雷伯氏菌JU1，在培養(yǎng)6 d 后對熒蒽的最高降解率可達 90%以上[8].

Ping L等[9]從土壤中分離得到雷伯氏菌菌株P(guān)L1，分別與20 mg/L 吡啶和10 mg/L苯并芘共培養(yǎng)10 d后，降解率分別達到63.4%和55.8%，對于受多環(huán)芳烴污染的土壤顯示了巨大的生物修復(fù)潛力.而較之單一種群，混合微生物種群通過代謝協(xié)作往往表現(xiàn)出對于毒性有機物的強耐受性和共代謝降解能力.Poulsen等[10]報道了一些難降解污染物的好氧降解過程中包含了多種微生物種群的共代謝作用.Liao等[11]用高濃度磺胺培養(yǎng)篩選出具有降解能力的功能微生物群落，培養(yǎng) 4周后平均磺胺降解率為78.3%，優(yōu)于單一種群降解的效果.從這個角度來說使用混合培養(yǎng)物進行目標(biāo)化學(xué)品的毒性效應(yīng)評價更符合實際微生物生態(tài)系統(tǒng)效能.

因此，本研究選取克雷伯氏菌屬和芽孢桿菌屬作為模式種群分別從純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)水平考察四種乙烯基類聚合物的生物學(xué)效應(yīng)，以期提供此類化學(xué)品的基礎(chǔ)微生物生態(tài)效應(yīng).

1 實驗部分

1.1 主要材料

受試菌株來源：分離自市政污水處理廠二沉池活性污泥中的克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)和芽孢桿菌屬(Bacillussp.)菌株，二者NCBI登錄號分別為KC753506和KC753503.甘油冷凍保存的菌株經(jīng)牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基活化和牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基劃線分離后，37 ℃恒溫振蕩(150 r/min)培養(yǎng)至OD600nm為0.305，濃度約為107CFU/mL時保存?zhèn)溆?

以表1中四種基于乙烯基類聚合物的皮革化學(xué)品作為評價對象，設(shè)置三個暴露濃度：100 mg/L、500 mg/L和1 000 mg/L，將不添加任何化學(xué)品的培養(yǎng)物視為對照.

1.2 實驗設(shè)置

純培養(yǎng)設(shè)置：在超凈工作臺中，各取2.5 mL克雷伯氏菌屬和芽孢桿菌屬擴繁菌液(見1.1)分別加入250 mL的錐形瓶中，并分別添加四種乙烯基類聚合物和牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基至100 mL并達到3個濃度水平，每個處理設(shè)置三個平行，37 ℃、150 r/min進行振蕩培養(yǎng).

混合培養(yǎng)設(shè)置：混合培養(yǎng)設(shè)置同純培養(yǎng)設(shè)置僅接種液不同，為預(yù)先1∶1(體積比)混合的克雷伯氏菌和芽孢桿菌擴繁菌液，混合菌液接種量與純培養(yǎng)暴露處理相同，總量為2.5 mL.

接種后0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h，24 h，36 h，48 h，72 h，108 h分別測定純培養(yǎng)處理的和混合培養(yǎng)處理的pH值及OD600nm值.

1.3 乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗

LDH是一類穩(wěn)定的胞內(nèi)酶[12]，正常情況下在所有細胞中保持幾乎相同的濃度，目前其作為一種生物標(biāo)志物基于檢測受損細胞釋放的LDH活性，從而實現(xiàn)對體外細胞系統(tǒng)中的細胞毒性/細胞溶解進行快速簡單地定量[13,14].因此，可通過LDH釋放實驗評估乙烯基類聚合物對供試菌株細胞膜完整性的影響.LDH活性通過細胞毒性檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所：A020-1)進行測定，將培養(yǎng)12 h的純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)物分別在12 000 g下離心5 min，在離心后的50μL上清液中加入0.25 mL基質(zhì)緩沖液(試劑盒配置)和0.05 mL的輔酶Ⅰ應(yīng)用液(試劑盒配置)，混勻后于37 ℃水浴中孵育15 min后再加入0.25 mL的 2,4-二硝基苯肼，混勻后于37 ℃再次水浴15 min，再加入0.4 mol/L NaOH溶液，混勻后室溫放置3 min后使用分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司，7200)在440 nm的波長下掃描記錄吸光度.其中：乳酸脫氫酶釋放率(%)=細胞外乳酸脫氫酶含量/(細胞內(nèi)乳酸脫氫酶含量+細胞外乳酸脫氫酶含量)×100%[15].

表1 實驗所用皮革化學(xué)品信息

注：DM為二甲基二烯丙基氯化銨，AM為丙烯酰胺，AA為丙烯酸，HEA為丙烯酸羥乙酯.

1.4 培養(yǎng)物胞內(nèi)活性氧水平檢測

為了闡明乙烯基類聚合物對供試菌株的可能抑制機理，使用2,7-二氯二氰熒光乙酰乙酸鹽標(biāo)記法[16](H2DCF-DA，分子探針，Invitrogen)檢測了供試培養(yǎng)物細胞內(nèi)的活性氧水平，以反映是否存在超氧自由基引起的胞內(nèi)損傷[17].具體方法：將短期暴露(12 h)后培養(yǎng)液經(jīng)400 g離心5 min后，使用0.1 M的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)清洗沉淀3～5次.使用0.1 M的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)配置終濃度為50μM的2,7-二氯二氰熒光乙酰乙酸鹽溶液，加入清洗后的沉淀并在室溫下避光孵育30 min，之后離心去除上清液，加入含有不同濃度類別乙烯基類聚合物的培養(yǎng)液(pH7.2)重懸沉淀，轉(zhuǎn)移至96孔板放置5 h后經(jīng)酶標(biāo)儀在485 nm 激發(fā)光和520 nm發(fā)射光濾鏡下記錄產(chǎn)生的二氯熒光素強度，計算活性氧水平.

實驗數(shù)據(jù)用 Origin 8.5進行制圖，用 SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)，并用 Bonferroni 法在P=0.01的置信水平檢驗處理組之間的差異顯著性.

2 結(jié)果與討論

2.1 乙烯基類聚合物暴露對培養(yǎng)生境pH的影響

由圖1(a)、(b)可知，在對克雷伯氏菌純培養(yǎng)和芽孢桿菌純培養(yǎng)過程中，分別添加了乙烯基類及納米復(fù)合鞣劑和涂飾劑后的培養(yǎng)液pH值隨時間的變化差異均較小，且穩(wěn)定在6.7～7.3的范圍內(nèi)，其屬于細菌生長適宜pH范圍[18,19]，且與空白對照組的pH變化同樣差異不大. 因此，乙烯基類及納米復(fù)合鞣劑和涂飾劑聚合物的添加并沒有對芽孢桿菌和克雷伯氏菌純培養(yǎng)體系的pH產(chǎn)生影響，排除了由于培養(yǎng)過程中pH的波動對微生物生長的干擾.

(a)克雷伯氏菌純培養(yǎng)

(b)芽孢桿菌純培養(yǎng)圖1 添加乙烯基類聚合物的克雷伯氏菌和芽孢桿菌純培養(yǎng)過程中pH的變化

2.2 乙烯基類聚合物暴露對克雷伯氏菌和芽孢桿菌純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)生長的影響

為獲得不同乙烯基類聚合物在各暴露濃度下分別對克雷伯氏菌和芽孢桿菌純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)生長的影響，用OD600nm值來表示細菌數(shù)目變化，即生長量變化.

圖2為純培養(yǎng)過程中不同聚合物類型以及不同暴露濃度對克雷伯氏菌生長的影響.由圖2(a)、(b)可知，LY-5和LY-8聚合物對克雷伯氏菌的生長抑制作用隨暴露濃度的增加而增加，導(dǎo)致其初始增長期時間增長，當(dāng)暴露濃度達到1 000 mg/L時克雷伯氏菌達到對數(shù)生長期的時間分別為10 h和8 h(空白對照組為4 h).相比之下，LY-5聚合物對于克雷伯氏菌的抑制作用較LY-8聚合物更為明顯.

由圖2(c)、(d)可知，當(dāng)LJL-2聚合物暴露濃度為500 mg/L時對克雷伯氏菌的生長有較為明顯的抑制作用，而相同暴露濃度下LJL-3聚合物純培養(yǎng)的克雷伯氏菌還是具有明顯的增長趨勢.因此，LJL-2聚合物對于克雷伯氏菌的抑制作用較LJL-3聚合物更為明顯且與暴露濃度呈正相關(guān).綜合比較乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑和鞣劑系列對于克雷伯氏菌的生長抑制作用發(fā)現(xiàn)，前者更為明顯.

(a)LY-5暴露下的克雷伯氏菌生長曲線

(b)LY-8暴露下的克雷伯氏菌生長曲線

(c)LJL-2暴露下的克雷伯氏菌生長曲線

(d)LJL-3暴露下的克雷伯氏菌生長曲線圖2 不同聚合物類型及暴露水平對克雷伯氏菌純培養(yǎng)生長的影響

圖3為純培養(yǎng)過程中不同聚合物類型以及不同暴露濃度對芽孢桿菌生長的影響.由圖3(a)、(b)可知，不同暴露濃度下LY-5和LY-8聚合物對芽孢桿菌的抑制作用相差不大，暴露濃度為1 000 mg/L下的培養(yǎng)物均在6 h時進入對數(shù)生長期.因此，芽孢桿菌對LY-5和LY-8聚合物均具有較高的耐受性.

結(jié)合圖3(c)、(d)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)LJL-2和LJL-3聚合物暴露濃度高于100 mg/L時對芽孢桿菌的生長就出現(xiàn)明顯的抑制作用，當(dāng)暴露濃度為1 000 mg/L時芽孢桿菌雖然可以生長，但遲滯期延長，對數(shù)生長期縮短，這在LJL-2暴露下表現(xiàn)更為明顯.因此，乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑系列對于芽孢桿菌的生長抑制作用較乙烯基類及納米復(fù)合鞣劑系列的更為明顯.

(a)LY-5暴露下的芽孢桿菌生長曲線

(b)LY-8暴露下的芽孢桿菌生長曲線

(c)LJL-2暴露下的芽孢桿菌生長曲線

(d)LJL-3暴露下的芽孢桿菌生長曲線圖3 不同聚合物類型及暴露水平對芽孢桿菌純培養(yǎng)生長的影響

圖4為不同聚合物類型以及不同暴露濃度對克雷伯氏菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)生長的影響.圖4(a)為在LY-5聚合物不同暴露濃度下混合培養(yǎng)物的生長變化趨勢，暴露濃度為1 000 mg/L時混合培養(yǎng)進入對數(shù)生長期的時間為4 h.圖4(b)中LY-8聚合物各暴露濃度下的混合培養(yǎng)均在4 h時進入了對數(shù)生長期.對比該系列聚合物暴露下純培養(yǎng)進入對數(shù)生長期的時間發(fā)現(xiàn)，其對克雷伯氏菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的抑制作用不明顯，甚至較純培養(yǎng)影響更小，說明共培養(yǎng)體系增加了微生物對污染物的耐毒害作用.

由圖4(c)可知，LJL-2聚合物各暴露濃度下混合培養(yǎng)的生長均沒有出現(xiàn)明顯的進入生長期的時間點.結(jié)合對克雷伯氏菌和芽孢桿菌的純培養(yǎng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LJL-2聚合物對純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)具有抑制作用.圖4(d)中LJL-3聚合物同樣對于混合培養(yǎng)生長具有較強的抑制作用，且不利影響表現(xiàn)為劑量依賴行為.綜上所述，混合培養(yǎng)體系可以減輕聚合物對微生物的抑制作用，其中乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑系列對于混合菌的抑制作用較為明顯.

(a)LY-5暴露下的混合培養(yǎng)物生長曲線

(b)LY-8暴露下的混合培養(yǎng)物生長曲線

(c)LJL-2暴露下的混合培養(yǎng)物生長曲線

(d)LJL-3暴露下的混合培養(yǎng)物生長曲線圖4 不同聚合物類型及暴露水平對混合培養(yǎng)物生長的影響

以上實驗結(jié)果表明，聚合物類型及不同暴露濃度對不同種群的生長影響有顯著差異，乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑系列聚合物對純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的抑制均較鞣劑系列聚合物更明顯，這可能與乙烯基聚合物結(jié)構(gòu)不同有關(guān).乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑系列聚合物含有大量的酯基，疏水性較強[20].乙烯基類及納米復(fù)合鞣劑系列聚合物除含有酯基外還有大量的羥基、酰胺基和親水基團羧基，疏水性較弱，且碳鏈較長，空間位阻較大[21].因此，具有更高親脂性的乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑系列聚合物更容易進入微生物細胞，使得細胞內(nèi)過氧化水平較高.因此，在皮革化學(xué)品的開發(fā)過程中不僅要考慮其性能還要考慮引入材料或基團的生態(tài)效應(yīng)，開發(fā)綠色皮革化學(xué)品.

2.3 乙烯基類聚合物暴露對混合培養(yǎng)物L(fēng)DH和ROS的影響

LDH是一種廣泛用于毒理學(xué)和臨床化學(xué)檢測的生物標(biāo)志物，用于診斷細胞、組織和器官損傷[22],其濃度變化反映了受影響組織的代謝活性變化[23].因此通過測定乙烯基類聚合物暴露處理和對照培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶濃度，可以用于評價乙烯基類聚合物對微生物細胞膜的損傷情況.

由圖5可知，不論是純培養(yǎng)還是混合培養(yǎng)，暴露處理的培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶濃度與對照相比處于同一水平，沒有顯著差異.說明此類皮革化學(xué)品的毒理效應(yīng)機制不在于細胞膜損傷.

圖5 不同聚合物類型及暴露水平對芽孢桿菌和克雷伯氏菌純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)LDH釋放率的影響

由圖6可知，暴露于乙烯基類聚合物的培養(yǎng)物細胞內(nèi)活性氧的水平相比于空白對照組均有所提高，說明活性氧脅迫是供試化學(xué)品微生物毒理效應(yīng)的主因.其中增長較大的為LY-5(500 mg/L)、LY-5(1 000 mg/L)、LY-8(1 000 mg/L)、LJL-2(500 mg/L)、LJL-2(1 000 mg/L)、LJL-3(500 mg/L)、LJL-3(1 000 mg/L)，且其大小順序大致為LJL-3(1 000 mg/L)> LJL-2(1 000 mg/L) > LY-5(1 000 mg/L)> LJL-2(500 mg/L)> LJL-3(500 mg/L)> LY-8(1 000 mg/L)> LY-5(500 mg/L).由此可見，乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑系列較乙烯基類及納米復(fù)合鞣劑系列的毒性作用更強，兩個系列的乙烯基類聚合物的毒性作用均與濃度呈正相關(guān)，濃度越高，毒性作用越強.

圖6 不同聚合物類型及暴露水平對芽孢桿菌和克雷伯氏菌純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)ROS產(chǎn)率的影響

不同種群對聚合物暴露的活性氧水平響應(yīng)也有顯著差異，如暴露于聚合物L(fēng)Y-5(1 000 mg/L)、LJL-2(500 mg/L、1 000 mg/L)和LJL-3(500 mg/L、1 000 mg/L)的芽孢桿菌純培養(yǎng)細胞內(nèi)活性氧水平明顯高于克雷伯氏菌純培養(yǎng)，說明乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑的聚合物對芽孢桿菌的毒理效應(yīng)較克雷伯氏菌顯著.

由暴露于乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑系列LJL-3(500 mg/L、1 000 mg/L)的芽孢桿菌純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)可知，混合培養(yǎng)下細胞內(nèi)的ROS水平顯著低于純培養(yǎng)體系.整體上，混合培養(yǎng)體系耐受性更強.低水平的ROS通常是生理上產(chǎn)生的，可以刺激活細胞的一些信號通路[24,25].然而，細胞內(nèi)過量的ROS會導(dǎo)致許多有害的影響，包括脂質(zhì)過氧化、DNA修飾和蛋白質(zhì)氧化，導(dǎo)致細胞損傷[26].混合培養(yǎng)體系在一定程度上可以減輕該類聚合物的毒害作用，這可能是由于采用混合培養(yǎng)策略能為微生物提供在純培養(yǎng)時無法獲得的物質(zhì)流交換，如為其提供生長必須的氨基酸[27]，使其生長率和降解效率都比純培養(yǎng)時顯著提高[28]，顯示活性污泥系統(tǒng)對此類皮革化學(xué)品具備一定的生物耐受度和相容性.因此，混合培養(yǎng)體系較之純培養(yǎng)體系對該類聚合物有更好的耐受性.

3 結(jié)論

乙烯基類聚合物的添加并沒有對芽孢桿菌和克雷伯氏菌純培養(yǎng)體系的pH產(chǎn)生影響，但對克雷伯氏菌、芽孢桿菌純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的抑制作用均呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系；乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑系列聚合物較鞣劑系列對克雷伯氏菌和芽孢桿菌純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的生長抑制更明顯；混合培養(yǎng)體系較純培養(yǎng)體系對聚合物具有更好的耐受性，可以減輕聚合物對其毒理效應(yīng)；此類化學(xué)品的毒理效應(yīng)機制不在于細胞膜損傷，而在于活性氧的脅迫.本研究表明，此類制革化學(xué)品對于活性污泥系統(tǒng)存在潛在毒理效應(yīng)，應(yīng)控制排放濃度在100 mg/L下，以減輕對于污水處理系統(tǒng)或者土壤微生物生態(tài)的影響.