秦俊哲，楊 苗，夏 飛，汪夢(mèng)雯，曾 橋

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

0 引言

茯茶因其獨(dú)特的發(fā)花工藝而成為黑茶中一個(gè)最具特色的產(chǎn)品，具有消食化積[1]，減肥[2,3]，降血脂[4,5]等功效.茯茶的加工過(guò)程是以三、四級(jí)黑毛茶為原料，經(jīng)過(guò)切割、篩分、拼配、勻堆、汽蒸渥堆、發(fā)花、干燥等一系列工藝過(guò)程制成[6].其中，渥堆是形成茶品質(zhì)的關(guān)鍵工序，其實(shí)質(zhì)是通過(guò)微生物胞外酶主導(dǎo)下的生化動(dòng)力以及熱主導(dǎo)下的物化動(dòng)力使茶葉內(nèi)含成分發(fā)生一系列復(fù)雜化學(xué)變化，形成茯茶特有風(fēng)味的過(guò)程[1].渥堆過(guò)程有助于降低毛茶的青澀味，促進(jìn)茶葉中功效成分轉(zhuǎn)化，為后續(xù)發(fā)花過(guò)程中冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)快速、大量生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ).

茶多酚、咖啡堿、茶氨酸是茶葉的三大特征成分[7].茶多酚具有增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、抗腫瘤、抗輻射等諸多功效[8-12].茶多酚含量越低，滋味越醇和[13]，茶多酚氧化生成茶黃素(TFs)[14]，可提升茶湯色澤.咖啡堿是茶湯中的苦味來(lái)源，具有提神益思，消除疲勞，解熱鎮(zhèn)痛，提高記憶力，促進(jìn)消化，降低膽結(jié)石機(jī)率等諸多保健功能[15].氨基酸是茯茶香氣、滋味物質(zhì)形成的重要前體[16]，具有抗病毒，改善睡眠，緩解焦慮癥，改善女性經(jīng)前綜合癥，增強(qiáng)肝臟排毒功能等功效[17,18].可溶性糖是茶湯中的甜味成分[19]，可溶性糖能夠遮蔽茶湯的苦澀味，增加茶湯醇厚感.其中單糖和雙糖是構(gòu)成茶葉水溶性糖的主要成分[20]，可為茯茶“發(fā)花”過(guò)程中關(guān)鍵的冠突散囊菌的繁殖提供碳源.

目前茯茶生產(chǎn)企業(yè)眾多，大多以小作坊式生產(chǎn)，渥堆工藝多憑經(jīng)驗(yàn)控制，極易造成茯茶品質(zhì)不高，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊等現(xiàn)象.近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者開始關(guān)注渥堆過(guò)程在茯茶品質(zhì)形成中的影響.渥堆過(guò)程中的微生物類群活躍，主要為細(xì)菌、黑曲霉及酵母[20]；不同渥堆條件對(duì)茯茶品質(zhì)影響已有相關(guān)報(bào)道[21]，劉石泉等[22]研究了不同渥堆處理后的茯磚茶成品中各理化指標(biāo)的變化，但對(duì)于渥堆過(guò)程中黑毛茶功效成分變化以及功效成分與“發(fā)花”之間的關(guān)系仍不甚明確.

為進(jìn)一步闡明渥堆條件對(duì)黑毛茶功效成分的影響及功效成分對(duì)散茶“發(fā)花”的作用.本研究通過(guò)正交試驗(yàn)方法，研究渥堆工藝中關(guān)鍵因子，原料毛茶水分含量、渥堆溫度、渥堆時(shí)間對(duì)茶多酚、咖啡堿、游離氨基酸及可溶性糖含量的影響；分析功效成分與冠突散囊菌生長(zhǎng)的相關(guān)性，揭示渥堆條件對(duì)黑毛茶中主要功效成分含量的影響，為進(jìn)一步科學(xué)有效地改良茯茶加工工藝，推動(dòng)茯茶產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展奠定理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

黑毛茶原料，市售；茯茶發(fā)酵劑[23]，實(shí)驗(yàn)室自制.

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、瓊脂、氯化鈉、濃硫酸、酒石酸鉀鈉、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、茚三酮、磷酸氫二鉀、濃鹽酸、蒽酮、堿式乙酸鉛，以上試劑均為分析純，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司試劑公司.

1.1.3 主要儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),SP-756PC，上海光譜儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器,LS-C50L，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱,101-2，北京科偉永興儀器有限公司；霉菌培養(yǎng)箱,MJ-160型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；人工氣候箱,LRH-400-GS智能型，廣東省醫(yī)療器械廠；超凈工作臺(tái),HS-840，蘇凈集團(tuán)安泰公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本研究在實(shí)驗(yàn)室模擬茯茶生產(chǎn)過(guò)程，每組稱取400 g原料，共9組處理，每組做兩個(gè)平行.使用高壓滅菌鍋在100 ℃條件下汽蒸5 min，之后以無(wú)菌水調(diào)節(jié)原料毛茶水分含量，置于人工氣候培養(yǎng)箱中在既定條件下進(jìn)行渥堆.

1.2.1 主要功效成分檢測(cè)

茶葉樣品的制備參照GB/T 8303-2013.茶多酚總量的測(cè)定采用酒石酸亞鐵比色法進(jìn)行[24]；游離氨基酸的測(cè)定參照GB/T 8314-2013；咖啡堿的測(cè)定參照GB/T 8312-2013；可溶性糖的測(cè)定采用蒽酮-硫酸比色法[25].

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ v3.1設(shè)計(jì)原料毛茶水分含量、渥堆溫度以及渥堆時(shí)間的3因素3水平L9(33)正交試驗(yàn)，考查各因素對(duì)于渥堆后毛茶中茶多酚、咖啡堿、游離氨基酸及可溶性糖含量四種主要功效成分的影響.

1.2.3 發(fā)花驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)不同處理組進(jìn)行人工接種散茶發(fā)花實(shí)驗(yàn)[26].發(fā)酵劑接種量為1.0‰[27].置于人工氣候培養(yǎng)箱中，在28 ℃發(fā)花7 d后，50 ℃下烘干，待測(cè).

1.2.4 冠突散囊菌數(shù)量

參照GB 4789.15-2016.

1.2.5 冠突散囊菌數(shù)量與茯茶渥堆后主要功效成分的相關(guān)性分析

應(yīng)用SPSS 20.0(SPSS statistics,IBM,USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，冠突散囊菌數(shù)量與主要功效成分的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析進(jìn)行雙側(cè)檢驗(yàn).

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

原料毛茶水分含量、渥堆溫度以及渥堆時(shí)間的3因素3水平L9(33)正交表設(shè)計(jì)如表1所示，同時(shí)顯示茶多酚、咖啡堿、游離氨基酸、可溶性糖這四種功效成分的含量及其極差分析.

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及主要功效成分的極差分析

2.1.1 渥堆條件對(duì)茶多酚的影響

圖1 不同因素水平對(duì)茶多酚含量的影響

2.1.2 渥堆條件對(duì)咖啡堿的影響

圖2 不同因素水平對(duì)咖啡堿含量的影響

2.1.3 渥堆條件對(duì)游離氨基酸的影響

圖3 不同因素水平對(duì)游離氨基酸含量的影響

2.1.4 渥堆條件對(duì)可溶性糖的影響

如表1所示，可溶性糖含量受原料毛茶水分含量、渥堆溫度以及渥堆時(shí)間的影響的極差為：RA>RC>RB，即各因素對(duì)可溶性糖含量的影響程度為：A(毛茶水分含量)>C(渥堆時(shí)間)>B(渥堆溫度).當(dāng)水分含量從25%提高至35%時(shí)，可溶性糖含量劇烈上升，約上升18.1%.

圖4 不同因素水平對(duì)可溶性糖含量的影響

2.2 “發(fā)花”實(shí)驗(yàn)

渥堆是茯茶“發(fā)花”前的關(guān)鍵工序，渥堆過(guò)程中毛茶原料中大分子物質(zhì)在水熱、微生物胞外酶作用下轉(zhuǎn)化為較小分子的物質(zhì)，可為茯茶“發(fā)花”過(guò)程中關(guān)鍵的冠突散囊菌的快速生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為進(jìn)一步探究渥堆對(duì)茯茶品質(zhì)的影響，對(duì)不同條件渥堆后的茯茶原料進(jìn)行人工接種“發(fā)花”.

表2是“發(fā)花”后的成品中冠突散囊菌的數(shù)量.分析冠突散囊菌的數(shù)量與四種功效成分的相關(guān)性，結(jié)果如表3所示，可溶性糖含量與冠突散囊菌數(shù)量顯著相關(guān)(p<0.05)，其相關(guān)系數(shù)為0.674.其余三組功效成分均未表現(xiàn)出與冠突散囊菌數(shù)量的顯著相關(guān)性.

表2 不同處理組的冠突散囊菌數(shù)量

表3 冠突散囊菌數(shù)量與四種功效成分的相關(guān)性

*表示在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)

2.3 討論與分析

在黑毛茶渥堆過(guò)程中，茶葉中大分子物質(zhì)在微生物胞外酶主導(dǎo)下的生化動(dòng)力以及熱主導(dǎo)下的物化動(dòng)力作用下，轉(zhuǎn)化為分子量較小的物質(zhì)，對(duì)于形成茯茶獨(dú)特風(fēng)味[28]以及為茯茶“發(fā)花”過(guò)程中關(guān)鍵菌株冠突散囊菌的大量生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ).

茶多酚類的轉(zhuǎn)化途徑主要有兩種：一是酶促氧化，二是自動(dòng)氧化和水解[29].渥堆過(guò)程中微生物的酶促作用促使多酚類分解，茶多酚含量在渥堆過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，并與后續(xù)的發(fā)酵程度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[21,30].本研究中，渥堆溫度為45 ℃時(shí)，渥堆后茶多酚含量較其他溫度處理組高.渥堆過(guò)程中的主要微生物為細(xì)菌，黑曲霉及酵母[20]，極可能是較高的溫度抑制了微生物的生長(zhǎng)，降低了微生物對(duì)毛茶原料中茶多酚的轉(zhuǎn)化作用.而當(dāng)溫度為55 ℃時(shí)，茶多酚的自動(dòng)氧化程度加劇，成為茶多酚含量變化的主要因素，因而55 ℃條件下渥堆后的茶原料中茶多酚含量明顯降低.

由于咖啡堿的環(huán)狀化學(xué)結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，不易被分解[31]，因此，渥堆溫度、渥堆時(shí)間對(duì)于咖啡堿含量影響較小.但咖啡堿含量隨著茶葉原料中水分含量提高而增加，極有可能是由于在較高水分含量下，原料毛茶中本身存在的黑曲霉生長(zhǎng)占據(jù)優(yōu)勢(shì).研究表明，咖啡堿與霉菌生長(zhǎng)有著密切關(guān)系[32]，有研究證實(shí)，在渥堆過(guò)程中微生物產(chǎn)生了一些咖啡堿[33].

在茯茶渥堆過(guò)程中，微生物利用茶葉中的氨基酸進(jìn)行生長(zhǎng)，可造成渥堆后氨基酸總量的減少，而茶葉原料中的蛋白質(zhì)又可降解為氨基酸，因此氨基酸的降解和生成達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡[34].在水分含量35%時(shí)，酵母、霉菌活性較強(qiáng)，分泌較多蛋白酶[35]，進(jìn)而加速茯茶原料中蛋白質(zhì)分解的速率.當(dāng)水分含量逐漸升高時(shí)，在濕熱及微生物作用下，氨基酸可能發(fā)生脫氨、脫羧反應(yīng).另一方面汽蒸、渥堆都處于高溫、高濕的條件下，會(huì)產(chǎn)生亞硝酸鹽，亞硝酸可與氨基酸作用生成相應(yīng)的羥基酸[36]，造成氨基酸含量減少.

茯茶原料渥堆過(guò)程中，可溶性糖含量增加可能是由于霉菌等微生物產(chǎn)生的纖維素酶及果膠酶分解纖維素和果膠，產(chǎn)生小分子的可溶性糖[35].在溫度達(dá)到55 ℃，原料水分含量為45%的高溫或高濕條件下，還原糖極易與氨基酸縮合產(chǎn)生希夫堿(Schiff Base)[37]，從而導(dǎo)致可溶性糖含量下降.本研究中，在水分含量由25%上升至35%時(shí)，可溶性糖含量劇烈上升，極可能是較高水分條件下，黑曲霉大量生長(zhǎng)，分泌出較多纖維素酶，分解纖維素產(chǎn)生糖類物質(zhì).可溶性糖含量與茯茶“發(fā)花”之后冠突散囊菌數(shù)量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(r=0.674，p<0.05)，即冠突散囊菌豐富度隨著茯茶原料渥堆后可溶性糖含量的增加而增加.茯茶“發(fā)花”程度是茯茶品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)[38]，為保證更好的“發(fā)花”效果，控制好渥堆條件，促進(jìn)茶葉中纖維素、果膠等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可供冠突散囊菌利用的小分子物質(zhì)，對(duì)于提高茯茶品質(zhì)具有重要的意義.

3 結(jié)論

渥堆過(guò)程中毛茶水分含量對(duì)茶多酚、咖啡堿、游離氨基酸、可溶性糖四種功效成分含量影響最大.隨著毛茶水分含量增加，茶多酚含量下降，咖啡堿含量上升.茶多酚、游離氨基酸含量隨渥堆時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，而可溶性糖含量先降低后增加.渥堆溫度的升高會(huì)提高游離氨基酸含量.相關(guān)性分析表明，可溶性糖含量與冠突散囊菌數(shù)量呈顯著正相關(guān)，極可能對(duì)后續(xù)發(fā)花工藝產(chǎn)生影響.因此，以黑毛茶中可溶性糖含量為控制渥堆條件可作為促進(jìn)茯茶“發(fā)花”的有效方式之一.