吳麗珺

(河南財政金融學院 體育系，河南 鄭州 450046)

0 引言

疲勞是指“機體的生理過程不能持續(xù)其機能在一特定水平或不能維持預定的運動強度”[1].疲勞有多種表現(xiàn)形式，其中力竭是疲勞的一種特殊表現(xiàn)形式，機體在疲勞狀態(tài)下繼續(xù)從事運動，直到肌肉或器官不能維持運動，即為力竭狀態(tài).自哈佛大學疲勞研究所開始重視疲勞問題的相關(guān)研究以來，疲勞的發(fā)生機制就一直是科學界研究的熱點問題.一百多年以來，學者們從不同的角度對疲勞機制進行了研究.包括衰竭學說、堵塞學說、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定失調(diào)學說、保護性抑制學說、突變理論與自由基損傷學說等理論[1]的出現(xiàn)，豐富了疲勞發(fā)生機制的研究體系，但仍難以解釋疲勞發(fā)生過程中的一些問題，如免疫機能的改變.因此，基于“J形曲線理論”[2]、“開窗理論”[3]、“免疫抑制因子調(diào)節(jié)學說”[4]等研究成果的基礎(chǔ)上，有學者將“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)”理論[5]引入到疲勞學說的研究當中.

隨著研究的進一步深入，研究者們發(fā)現(xiàn)，免疫機能如細胞免疫或體液免疫水平的降低并不是身體機能下降的主要因素，而免疫平衡的改變?nèi)?型T細胞(T cell-1, T1)/2型T細胞(T cell-2, T2)失衡才是抑制身體機能的主要誘因.T1/T2平衡主要用于判斷機體細胞免疫與體液免疫之間的平衡狀態(tài)，T1、T2型細胞因子分泌的改變是T1/T2平衡常用的評價依據(jù).γ-干擾素(Interferon-γ, IFN-γ)、白細胞介素-4(Interleukin-4, IL-4)是T1、T2細胞分泌的最典型的細胞因子[6, 7]，兩者分泌水平的變化都會導致T1/T2失衡，從而影響身體機能.然而，在疲勞發(fā)生過程中，導致T1/T2失衡的機制目前還不清楚.研究發(fā)現(xiàn)，抗原提呈細胞(Antigen presenting cell, APC)所產(chǎn)生的白細胞介素-12(Interleukin-12, IL-12)、白細胞介素-27(Interleukin-27, IL-27)是介導IFN-γ分泌、啟動T1型免疫反應的關(guān)鍵細胞因子[8-11].那么，疲勞發(fā)生過程中T1/T2平衡的變化是否與IL-12、IL-27分泌的改變有關(guān)，仍需實驗進行證實.因此，本研究擬采用力竭游泳運動訓練的方式建立大鼠疲勞模型，通過觀察疲勞大鼠T1/T2平衡的變化及其與IL-12、IL-27的關(guān)系，探討疲勞大鼠T1/T2失衡的可能機制.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物及分組

20只清潔級SD大鼠，體質(zhì)量341±27 g，8周齡.飼養(yǎng)按照要求進行，飼養(yǎng)環(huán)境溫度18 ℃～25 ℃，相對濕度40%～60%，自然光照，自由飲食和飲水.大鼠適應喂養(yǎng)1周后進行分組，隨機分成正常對照組(A組，n=10)與疲勞模型組(B組，n=10)兩組，分組后兩組大鼠體質(zhì)量無顯著差異.

1.2 疲勞模型的建立

借助力竭游泳運動訓練的方式，采用文獻[12]的大鼠游泳力竭標準(大鼠協(xié)調(diào)動作消失，水淹沒鼻尖，身體下沉，至再次浮出水面時長超過10 s，連續(xù)3次且放于游泳池外平臺無法完成翻正反射)建立大鼠疲勞模型.對B組大鼠采用力竭游泳運動訓練的方式建立疲勞模型，A組大鼠不進行任何針對性活動安排.為使大鼠能夠適應游泳，先讓其學習游泳3 d，第1 d游泳10 min，第2 d游泳15 min，第3 d游泳20 min，然后進行5周的力竭游泳運動訓練.具體訓練方案見表1.

表1 大鼠力竭游泳訓練方案Tab. 1 Exhaustive swimming training program in rats

大鼠游泳時間采用每天逐漸增加的方式，時間增加的幅度依據(jù)大鼠每天游泳訓練后的疲勞狀態(tài)和第2 d的活動情況來安排.負重采用小重量的螺絲帽，由鑰匙環(huán)串成，根據(jù)大鼠每日體質(zhì)量的百分比通過增減螺絲帽的數(shù)量來控制負重大小.負重由小皮筋連接綁在大鼠上肢的腋下部位.游泳訓練過程中重點觀察大鼠動作的協(xié)調(diào)程度，當大鼠動作出現(xiàn)明顯不協(xié)調(diào)、沉入水底后不能保持站立姿勢時，迅速撈起并用干毛巾擦干讓其休息5 min左右，之后再放入游泳池中[13].游泳訓練期間，詳細觀察和記錄大鼠的運動能力、疲勞狀態(tài)與活動情況.游泳池水深為50 cm，水溫29 ℃±1 ℃.

1.3 測試樣本的采集、處理與測試

在完成最后一次力竭游泳后24 h，采集B組大鼠股動脈血2 mL.A組大鼠同時間段取血，采集股動脈血2 mL.血液樣本采用3000 r/min離心5 min，收集上清液為血清，采用雙抗體夾心親和素-生物素復合-酶聯(lián)免疫吸附測定法(ABC-ELISA法)測試血清中IFN-γ、IL-4、IL-12、IL-27含量，測試方法嚴格按照試劑盒說明書進行.

1.4 數(shù)理統(tǒng)計

2 實驗結(jié)果

2.1 B組大鼠游泳訓練及活動情況

在力竭游泳運動訓練的第5周，B組大鼠溺水死亡2只，其余均完成運動訓練安排，因此B組實際納入本研究數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計的樣本為8個.游泳訓練第1、2周，每天訓練結(jié)束后大鼠活動逐漸減少，但在第2 d仍能恢復至訓練前的精神狀態(tài).第3、4、5周隨著訓練時間和負重的增加，每天訓練結(jié)束后大鼠活動呈現(xiàn)明顯的疲勞狀態(tài)，出現(xiàn)肌力明顯減弱、軀干代替四肢支撐身體休息、在外力的驅(qū)趕下仍不活動等現(xiàn)象，且在第2 d疲勞狀態(tài)仍未恢復，飼養(yǎng)籠內(nèi)的活動明顯減少.

2.2 疲勞大鼠血清IFN-γ、IL-4含量變化

采用ABC-ELISA法對大鼠血清IFN-γ、IL-4含量進行測試，并計算IFN-γ/IL-4比值，見表2.

表2 兩組大鼠IFN-γ、IL-4含量的比較Tab. 2 Comparison of IFN-γ、IL-4 between the two groups of rats

注：“★”表示與A組相比，P<0.05.

比較兩組結(jié)果發(fā)現(xiàn)：B組大鼠血清IFN-γ含量(159.02±39.08 ng/L)低于A組(205.88±34.24 ng/L)，且存在顯著性差異(P=0.015)；B組大鼠血清IL-4含量(56.61±15.97 ng/L)高于A組(54.17±17.89 ng/L)，統(tǒng)計分析未呈現(xiàn)顯著性差異(P=0.767)；B組大鼠血清IFN-γ/IL-4比值(2.92±0.69)低于A組(4.12±1.35)，存在顯著性差異(P=0.037).

2.3 疲勞大鼠血清IL-12、IL-27含量的變化

采用ABC-ELISA法對大鼠血清IL-12、IL-27含量進行測試，見表3.由表3可見，B組大鼠血清IL-12含量(42.20±13.41 ng/L)低于A組(57.60±15.86 ng/L)，且存在顯著性差異(P=0.044)；B組大鼠血清IL-27含量(17.70±6.06 ng/L)也低于A組(22.56±5.12 ng/L)，但未達到顯著性差異水平(P=0.084).

表3 兩組大鼠IL-12、IL-27含量的比較Tab. 3 Comparison of IL-12、IL-27 between the two groups of rats

2.4 大鼠血清IL-12、IL-27與IFN-γ的相關(guān)性

從Pearson相關(guān)性檢驗結(jié)果來看，大鼠血清IL-12與IFN-γ的含量顯著相關(guān)(r=0.704，P<0.01)，但血清IL-27與IFN-γ的含量無顯著相關(guān)(r=0.212，P>0.05)，血清IL-12與IL-27的含量也無顯著相關(guān)(r=0.074，P>0.05).

3 分析與討論

3.1 疲勞模型大鼠T1/T2平衡的變化

在免疫平衡中，T1/T2平衡主要用于反映細胞免疫與體液免疫之間的平衡狀態(tài).IFN-γ等細胞因子分泌相對增多或IL-4等細胞因子分泌相對減少，表明細胞免疫反應增強，T1/T2平衡向T1方向偏移；反之，IL-4等細胞因子分泌相對增多或IFN-γ等細胞因子分泌相對減少，表明體液免疫反應增強，T1/T2平衡則向T2方向偏移.相比之下，IFN-γ/IL-4比值的變化更能直觀地反映T1/T2平衡的變化，該比值的增大和減小可直接反映細胞免疫與體液免疫之間的平衡變化.基礎(chǔ)研究認為，機體的免疫機能需要在整體水平上保持動態(tài)平衡，在獲得性免疫階段，細胞免疫與體液免疫之間需保持動態(tài)平衡，不然將會導致疾病、造成病理損傷或加重病情[14].其中，未達到疾病的疲勞狀態(tài)也可能與細胞免疫和體液免疫的失衡有關(guān).為避免末次游泳訓練所引起的應激反應對實驗結(jié)果造成影響，本研究將取材時間定為末次游泳訓練后24 h.本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疲勞模型大鼠血清IFN-γ含量顯著降低(P<0.05)，但血清IL-4含量未發(fā)生明顯變化(P>0.05).此外，疲勞模型大鼠血清IFN-γ/IL-4比值也顯著降低(P<0.05).以上研究結(jié)果表明，疲勞模型大鼠會出現(xiàn)T1/T2失衡，表現(xiàn)為T1型免疫反應抑制，細胞免疫功能下降，而T1/T2失衡可能是導致大鼠疲勞的重要誘因.同類研究中，蘇利強等研究發(fā)現(xiàn)，10 d遞增負荷游泳至力竭后8 h，外周血血清IFN-γ水平與血清IFN-γ/IL-4比值均顯著下降[15]；5周遞增負荷游泳至力竭后24 h，外周血血清IFN-γ水平與血清IFN-γ/IL-4比值也均顯著下降(P<0.05)[12].另一項研究中，4周遞增負荷游泳訓練可引起大鼠血漿IFN-γ含量顯著降低(P<0.01)，血漿IFN-γ/IL-4比值也顯著降低(P<0.05)[16].以上研究與本研究結(jié)果呈現(xiàn)一致的變化趨勢.

3.2 疲勞模型大鼠IL-12、IL-27的變化及其與T1/T2平衡的關(guān)系

T1細胞的分化與IFN-γ的產(chǎn)生與細胞因子IL-12、IL-27的作用有關(guān),IL-12是T1細胞分化的啟動細胞因子[8].研究發(fā)現(xiàn)，用抗IL-12的血清耗盡IL-12或者基因敲除IL-12時，會抑制細胞因子IFN-γ的分泌[17].IL-12是由APC分泌、由p35與p40兩條多肽鏈通過二硫鍵共價結(jié)合形成的異二聚體(p70)[18]，通過與同樣由2條型的受體(IL-12R1、IL-12R2)形成[19]的IL-12R結(jié)合，啟動胞內(nèi)的Janus激酶(Janus kinase, JAK)/信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducers and activators of transcription, STAT)信號通路的轉(zhuǎn)導與IFN-γ mRNA等的轉(zhuǎn)錄[20].IL-27同屬IL-12家族成員，也主要由APC分泌.與IL-12結(jié)構(gòu)類似，IL-27也是由兩條多肽鏈通過二硫鍵組成，分別為p28(IL-12 p35的相關(guān)多肽)和EB病毒誘導基因3(Epstein-Barr virus induced gene 3, EBI3)，通過啟動胞內(nèi)不同JAK/ STAT信號通路的轉(zhuǎn)導來促進IFN-γ 的分泌[21].此外，IL-12與IL-27在促進T1細胞分化與IFN-γ產(chǎn)生的過程中還具有協(xié)同作用.

目前，疲勞機體T1/T2平衡與IL-12的關(guān)系已有相關(guān)研究進行探討[16, 22-24]，但與IL-27的關(guān)系尚未見相關(guān)研究報道.美國學者以1-型單純皰疹病毒感染小鼠為實驗對象研究發(fā)現(xiàn)，在遞增負荷運動至力竭并感染病毒2 d后，小鼠脾細胞分泌的IL-12與IFN-γ均顯著降低[23].日本學者以運動員為實驗對象研究發(fā)現(xiàn)，力竭運動后運動員血漿IFN-γ活性下降，而血漿IL-12p40(IL-12的拮抗劑)卻顯著升高[24].我國學者研究發(fā)現(xiàn)，4周遞增負荷游泳訓練不僅可引起大鼠血漿IFN-γ含量顯著降低(P<0.01)、血漿IFN-γ/IL-4比值顯著降低(P<0.05)，還可引起大鼠血漿IL-12含量顯著降低(P<0.01)，且大鼠血漿IL-12與IFN-γ的含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)[16].本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疲勞模型大鼠血清IFN-γ含量與IL-12含量均顯著低于正常對照組(P<0.05)，但血清IL-27含量與正常對照組相比無顯著性差異.此外，大鼠血清IL-12與IFN-γ的含量呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，但血清IL-27與IFN-γ含量、IL-12與IL-27含量之間均無顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05).

4 結(jié)論

經(jīng)過5周力竭游泳運動訓練，疲勞大鼠出現(xiàn)T1/T2失衡，表現(xiàn)為T1型免疫反應抑制，細胞免疫功能下降，而T1/T2失衡是導致大鼠疲勞的重要誘因.疲勞大鼠T1/T2平衡的變化與IL-12分泌的變化有關(guān)，但與IL-27分泌的關(guān)系并不密切.

本研究中:(1)疲勞模型組大鼠負重游泳運動強度較大，導致2只大鼠在力竭游泳過程中溺水死亡，最后實際納入本研究數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計的樣本僅為8個.未來的相關(guān)實驗研究應注意觀察大鼠游泳過程中動作的協(xié)調(diào)程度，預判大鼠的疲勞狀態(tài)并及時做好救護準備.(2)受研究經(jīng)費等的限制，本研究僅觀察了末次訓練后24 h一個時相，研究結(jié)果雖能揭示疲勞大鼠T1/T2平衡的變化，但無法深入了解在大鼠疲勞發(fā)生發(fā)展過程中T1/T2平衡的變化和作用，建議未來的相關(guān)實驗研究增加如末次訓練后8、24、72 h等時相的觀察.