張 然 鄭 琛 閆曉剛 梁 浩 班志彬 楊華明*

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院，公主嶺136100；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070)

牛至油(oregano essential oil)是從植物牛至的葉和花中提取的一種揮發(fā)性油，主要活性成分為香芹酚(carvacrol，香荊介酚，2-甲基-5-異丙基苯酚)和百里酚(thymol，麝香草酚，5-甲基-2-異丙基苯酚)[1]，其活性成分具有廣譜高效的抗菌活性，與抗生素相比具有高效、環(huán)保、無殘留、無毒、不產(chǎn)生耐藥性等顯著特點，可代替抗生素在飼糧中添加，是我國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的抗菌促生長添加劑(農(nóng)牧法[2001]20)。牛至油的抗菌、殺菌作用主要是通過牛至油中的酚類化合物與細(xì)菌的細(xì)胞膜作用而改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增加了細(xì)胞膜的流動性和通透性或與細(xì)胞膜中的磷脂反應(yīng)，破壞蛋白質(zhì)的合成，使微生物細(xì)胞的生長受到抑制[2]。牛至油中的酚酸類和萜類物質(zhì)可發(fā)揮抗氧化作用[3]。有研究表明，飼糧中添加牛至油可提高動物血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性和顯著降低血清丙二醛濃度。同時，牛至油可提高動物免疫力，促進(jìn)免疫器官生長發(fā)育[4]。

植物精油可選擇性地抑制產(chǎn)甲烷菌、原蟲和超級產(chǎn)氨菌等特定的微生物，這也是植物精油調(diào)控瘤胃發(fā)酵的主要機(jī)理[5-6]。一般認(rèn)為，牛至油調(diào)控瘤胃發(fā)酵的正效應(yīng)是降低乙酸和氨氮濃度及甲烷產(chǎn)量，升高丙酸和丁酸濃度，從而降低乙酸/丙酸，維持反芻動物葡萄糖代謝平衡。已有體外試驗表明，牛至油在體外培養(yǎng)條件下能發(fā)揮類似于離子載體的作用，使得培養(yǎng)液的甲烷產(chǎn)量、乙酸、丙酸、丁酸和氨氮濃度及乙酸/丙酸發(fā)生改變，但這些結(jié)論都是在體外模擬反芻動物瘤胃環(huán)境的試驗中得出的。雖然體外法能夠直觀地反映牛至油對瘤胃發(fā)酵的調(diào)控效果，但真實的反芻動物瘤胃內(nèi)環(huán)境更復(fù)雜，影響因素多，變化快，體內(nèi)環(huán)境和體外環(huán)境存在著較大差異。本試驗通過在瘺管綿羊的基礎(chǔ)飼糧中添加牛至油，研究牛至油不同添加水平對瘤胃發(fā)酵特性及飼糧營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解率的影響，旨在獲取牛至油的最適添加水平和驗證體外試驗結(jié)果，為牛至油在綿羊養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牛至油購自涵樂生物科技有限公司(江蘇，興化)，純度為10%，其余部分為載體，成分為二氧化硅。

1.2 試驗設(shè)計及分組

選用4只裝有永久瘤胃瘺管的新疆細(xì)毛羊×杜泊羊雜交的4周歲公綿羊，平均體重(40.83±4.11) kg，采用4×4拉丁方試驗設(shè)計，對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0.015%、0.030%和0.045%牛至油的試驗飼糧。試驗共分4期，每期12 d，其中預(yù)試期10 d，正試期2 d，于預(yù)試期內(nèi)添加相應(yīng)水平的牛至油。試驗綿羊分組見表1。

表1 試驗綿羊分組

1.3 基礎(chǔ)飼糧及飼養(yǎng)管理

參照肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 816—2004)推薦的育成公羊營養(yǎng)需要量(體重40 kg，日增重100 g)配制飼糧，飼糧精粗比為30∶70，其組成及營養(yǎng)水平見表2。每日于07:00和17:00等量飼喂2次，先粗后精，自由飲水。

1.4 待測飼糧的處理

飼糧粉碎過40目篩備用。尼龍袋大小為12 cm×8 cm，孔徑為0.045 mm。稱取5 g飼糧樣品放入尼龍袋內(nèi)，每6袋放入1個大的網(wǎng)袋中，根據(jù)“同時放入，依次取出”的原則，于正試期第1天晨飼前放入瘤胃內(nèi)，處理6、12和24 h后取出，每次取出2個尼龍袋，即每個時間點有2個重復(fù)。取出的尼龍袋立即在自來水下沖洗，然后放入水中浸泡45 min，再在中等流速的自來水下漂洗后將尼龍袋65 ℃烘干，以測定飼糧干物質(zhì)(DM)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和粗蛋白質(zhì)(CP)含量。

1.5 瘤胃液的采集

于正試期的第2天，在試驗羊0(晨飼前，07：00)、2(09：00)、4(11：00)、6(13：00)和10 h(晚飼前，17：00)從瘤胃內(nèi)不同位點采集瘤胃液，立即測定pH，然后于-20 ℃冷凍保存，以測定總氮(TN)、氨氮(NH3-N)、尿素氮(UN)和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度。

1.6 測定指標(biāo)及測定方法

瘤胃液pH：用酸度計(pHS-3C，上海雷磁儀器廠)測定。瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸濃度：用氣相色譜儀(6890N，Agilent，美國)測定；色譜柱為HP19091N-213毛細(xì)管柱(Agilent，美國)；色譜條件為進(jìn)樣口溫度220 ℃，氮氣流量2.0 mL/min，分流比為40∶1，進(jìn)樣量0.6 μL，程序升溫模式(120 ℃，3 min，然后10 ℃/min至180℃，保持1 min)，火焰離子檢測器(FID)250 ℃，F(xiàn)ID空氣、氫氣和氮氣流量分別為450、40和45 mL/min。瘤胃液總氮和飼糧及殘渣中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分、鈣、磷和水分含量：粗蛋白質(zhì)含量用凱氏定氮法測定；粗脂肪含量依據(jù)國標(biāo)(GB/T 6433—2006)方法測定；鈣和磷含量依據(jù)國標(biāo)(GB/T 6437—2002)方法測定；其余指標(biāo)測定方法參見《飼料分析與飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》[7]。瘤胃液氨氮濃度：用馮宗慈等[8]改進(jìn)的比色法測定。瘤胃液尿素氮濃度：用二乙酰一肟法測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。飼糧及殘渣中中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量：按照Van Soest等[9]的方法測定。按下式公式計算各營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解率：

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of the diet：Fe 38 mg，Zn 44 mg，Cu 15 mg，I 0.5 mg，Mn 50 mg，Se 0.3 mg，Co 0.05 mg，VA 354 IU，VD 94.4 IU，VE 1.06 mg。

2)消化能為實測值。DE was a measured value.

營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解率(%)=[(尼龍袋內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)含量-降解數(shù)小時后尼龍袋內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)含量)/尼龍袋內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)含量]×100。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件的拉丁方方差分析處理數(shù)據(jù)，差異顯著時，采用Tukey法(方差齊)或Tamhane法(方差不齊)進(jìn)行多重比較，以P<0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛至油對綿羊飼糧營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解率的影響

由表3可知，添加牛至油對飼糧各營養(yǎng)物質(zhì)的瘤胃降解率均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，同一添加水平的牛至油在不同時間點的營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解率隨飼糧在體內(nèi)降解時間越長，各養(yǎng)分降解率越高。

2.2 牛至油對綿羊瘤胃液pH和揮發(fā)性脂肪酸濃度和比例的影響

由表4可知，添加牛至油對綿羊瘤胃液pH無顯著差異(P>0.05)。0.030%組和0.045%組綿羊瘤胃液4 h的總揮發(fā)性脂肪酸濃度顯著低于對照組(P<0.05)；0.015%組綿羊瘤胃液0、2、6 h乙酸比例顯著低于其余各組(P<0.05)，6 h的乙酸/丙酸顯著低于其余各組(P<0.05)，而2 h丙酸比例顯著高于除了對照組外的其余各組(P<0.05)。

2.3 牛至油對綿羊瘤胃液氮濃度的影響

由表5可知，飼糧中添加牛至油對綿羊瘤胃液的總氮、氨氮和尿素氮濃度均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

表3 牛至油對綿羊飼糧營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解率的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with no or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表4 牛至油對綿羊瘤胃液pH和揮發(fā)性脂肪酸濃度和比例的影響

續(xù)表4項目Items時間Time/h牛至油添加水平Oregano essential oil supplement level/%00.0150.0300.045SEMP值P-value丙酸Propionate/%013.6615.0713.4613.630.300.206216.97ab17.61a16.30b16.48b0.180.040415.8116.6315.5315.500.220.226615.2016.4614.9415.160.220.0531014.2815.2314.2714.400.230.406丁酸Butyrate/%07.117.747.447.260.100.11128.559.238.528.370.130.08148.358.808.618.240.130.40968.278.658.358.210.120.572108.058.127.947.520.120.280其他酸Others/%02.172.302.072.150.050.50122.963.152.963.100.040.26942.402.452.402.020.080.14762.002.192.011.800.070.284101.882.071.571.630.090.147

表5 牛至油對綿羊瘤胃液氮濃度的影響

3 討 論

3.1 牛至油對綿羊飼糧營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解率的影響

利用尼龍袋法能較準(zhǔn)確地評價飼糧營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃內(nèi)的降解效果且操作簡單，而干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維是評價飼糧營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解率的重要指標(biāo)[10]。本次試驗中，牛至油對干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的瘤胃降解率均沒有產(chǎn)生顯著影響。這是由于營養(yǎng)物質(zhì)的消化率主要是由營養(yǎng)物質(zhì)的理化性質(zhì)決定，益生元不能改變飼糧營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，只能改變細(xì)菌的數(shù)量從而影響纖維的降解率[11]。也可能因為添加牛至油后并未降低真菌的數(shù)量，也不會對纖維的降解產(chǎn)生影響[12]。Benchaar等[13]用安裝瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛進(jìn)行拉丁方試驗，分別給以青貯苜蓿和青貯玉米為基礎(chǔ)飼糧的奶牛飼喂750 mg/d混和植物精油，干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的瘤胃降解率都沒有產(chǎn)生顯著影響，與本試驗研究結(jié)果一致。但有研究認(rèn)為，精油的作用效果與飼糧類型有關(guān)，植物精油進(jìn)入瘤胃后，可能通過改變瘤胃微生物對飼糧的附著和定植，從而影響飼糧可溶組分的裂解；當(dāng)采用瘤胃可溶物質(zhì)作為基礎(chǔ)飼糧時，植物精油對飼糧蛋白質(zhì)或肽的水解沒有影響，只是抑制了氨基酸的脫氨基作用[14]。Molero等[14]將700 mg/(d·頭)混和精油添加到育成牛的飼糧中，結(jié)果表明，混和精油只降低了高精料飼養(yǎng)條件下的粗蛋白質(zhì)降解率。Newbold等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊精粗比為40∶60的基礎(chǔ)飼糧中添加混和精油，降低了豆粕的粗蛋白質(zhì)降解率。Mcewan等[16]給綿羊飼喂混和精油，影響了瘤胃微生物對富含淀粉的谷物飼糧和富含蛋白質(zhì)的粕類飼糧的附著和定植的能力，Duval等[17]試驗也得出了相同的結(jié)論。而大多數(shù)體外試驗的結(jié)果卻表明，植物精油會影響飼糧營養(yǎng)物質(zhì)體外降解率。Righi等[18]體外試驗結(jié)果顯示，添加0.5 mg/L牛至油能顯著降低豆粕4和24 h的干物質(zhì)降解率及玉米粉和全混合日糧24 h的干物質(zhì)降解率。Kilic等[19]試驗也得出在含有大麥、大豆和麥秸的混和飼糧中添加牛至油產(chǎn)氣量顯著降低。白烏日汗[20]通過體外批次培養(yǎng)法測定添加水平為0、45、450和4 500 mg/L的牛至油對瘤胃發(fā)酵特性的影響，發(fā)酵0、2、6和24 h后，綜合各時間點平均值得出，45 mg/L組和450 mg/L組干物質(zhì)降解率顯著高于對照組，但4 500 mg/L組與對照組相比沒有顯著差異。

3.2 牛至油對綿羊瘤胃液pH和揮發(fā)性脂肪酸濃度和比例的影響

pH是評價瘤胃代謝的重要指標(biāo)，主要受飼糧性質(zhì)、唾液分泌量和有機(jī)酸積累的影響，決定著瘤胃微生物對底物的發(fā)酵利用情況[21]。揮發(fā)性脂肪酸主要來源于飼糧中碳水化合物的發(fā)酵，是供應(yīng)反芻動物能量代謝的主要形式，可為反芻動物提供所需能量的60%～80%，乙酸、丙酸及丁酸是飼糧在瘤胃中發(fā)酵后的主要產(chǎn)物。本次試驗中，牛至油對綿羊瘤胃液pH沒有顯著影響，各組綿羊瘤胃液的pH在5.61～6.42，處于有利于微生物發(fā)酵的變化范圍內(nèi)(5.5～7.5)[22]。各組綿羊pH的變化也符合飼喂前最高，采食后1～5 h降至最低點，而后緩慢回升的規(guī)律?？倱]發(fā)性脂肪酸濃度的變化隨時間表現(xiàn)出先升高后降低的規(guī)律，是因為動物進(jìn)食后刺激了瘤胃微生物的生長和繁殖，發(fā)酵過程產(chǎn)生大量的揮發(fā)性脂肪酸，但因有機(jī)酸不斷被瘤胃壁吸收或流入消化道后段或被唾液中的緩沖物質(zhì)中和，使得瘤胃內(nèi)pH又緩慢上升，總揮發(fā)性脂肪酸濃度逐漸降低，說明瘤胃內(nèi)有機(jī)酸的積累是影響瘤胃內(nèi)pH的主要因素。本次試驗中，添加牛至油0.030%和0.045%時綿羊瘤胃液4 h的總揮發(fā)性脂肪酸濃度顯著低于對照組；0.015%組綿羊瘤胃液0、2、6 h乙酸比例顯著低于其余各組，6 h的乙酸/丙酸顯著低于其余各組，而2 h丙酸比例顯著高于除了對照組外的其余各組。有關(guān)牛至油對反芻動物瘤胃發(fā)酵影響的測定，以體外試驗居多且結(jié)果不一，如有研究認(rèn)為飼糧中添加牛至油會降低瘤胃內(nèi)總揮發(fā)性脂肪酸濃度[23-24]或?qū)ζ錈o影響[25-26]，但也有研究認(rèn)為，添加牛至油可增加瘤胃內(nèi)總揮發(fā)性脂肪酸濃度[27-28]。而一些體內(nèi)試驗結(jié)果表明，飼喂牛至油或精油混合物對瘤胃發(fā)酵指標(biāo)無顯著影響。如Beauchemin等[25]報道，肉牛飼喂混合植物精油1 g/d時，對瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸濃度及單個揮發(fā)性脂肪酸濃度無影響；Benchaar等[13]試驗也表明，泌乳奶牛飼糧添加混合植物精油750 mg/d時，對瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸濃度、單個揮發(fā)性脂肪酸濃度和乙酸/丙酸都無顯著影響；石寧[29]選用4頭瘤胃瘺管奶牛，采用4×4拉丁方設(shè)計，研究牛至油對泌乳奶牛瘤胃發(fā)酵的影響，對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組牛至油添加水平為250、500和750 g/d，試驗結(jié)果表明，牛至油對奶牛瘤胃pH、總揮發(fā)性脂肪酸濃度和除丁酸比例以外的其他單個揮發(fā)性脂肪酸濃度均無顯著影響。Giannenas等[30]在母羊飼糧中添加不同水平含有麝香草酚的植物精油混合物(0、50、100和150 mg/kg)，結(jié)果表明植物精油對綿羊瘤胃液pH、總揮發(fā)性脂肪酸濃度及單個揮發(fā)性脂肪酸濃度均沒有顯著影響，但添加組較對照組顯著降低了乙酸/丙酸。Günal等[31]體外試驗表明，百里香油添加水平為125、250和500 mg/L時，體外發(fā)酵液pH、乙酸、丙酸、丁酸比例和乙酸/丙酸無顯著差異。此外，飼糧中添加牛至油對綿羊瘤胃發(fā)酵的影響較小，不如體外培養(yǎng)時的效果顯著，主要是由于牛至油的特殊氣味限制了其在動物飼糧中的添加水平，使得牛至油有效添加水平較低，再加上活體環(huán)境遠(yuǎn)比體外培養(yǎng)復(fù)雜，導(dǎo)致動物試驗與體外培養(yǎng)結(jié)果出現(xiàn)較大差異。

3.3 牛至油對綿羊瘤胃液氮濃度的影響

本試驗中牛至油對綿羊瘤胃液總氮、氨氮和尿素氮濃度均沒有產(chǎn)生顯著影響，氨氮濃度在11.14～20.34 mg/dL，符合瘤胃微生物最佳生長所需的氨氮濃度(8.5～30.0 mg/L)[32]。瘤胃液氨氮濃度與飼糧蛋白質(zhì)或含氮物降解速度、瘤胃內(nèi)微生物合成氨的能力、能量及碳架供給有關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為植物精油能夠抑制瘤胃產(chǎn)氨菌的生長，降低脫氨酶活性，使得氨基酸脫氨基作用降低[33-34]。Giannenas等[30]試驗表明植物精油對總活菌、纖維分解菌和原蟲數(shù)量無影響，但100和150 mg/kg植物精油組顯著降低了瘤胃超級產(chǎn)氨菌數(shù)量，150 mg/kg植物精油降低瘤胃氨氮濃度。Wang等[35]給綿羊基礎(chǔ)飼糧中添加250 mg/d牛至油預(yù)混劑，連續(xù)飼喂15 d后與對照組相比，綿羊瘤胃液氨氮濃度顯著降低。石寧[29]體內(nèi)試驗表明，隨牛至油添加水平的增加，奶牛瘤胃液氨氮濃度顯著降低，各組間尿素氮濃度差異不顯著。Castillejos等[24]用體外批次培養(yǎng)研究植物精油活性成分對瘤胃發(fā)酵特性的影響，發(fā)酵24 h后，500和5 000 mg/L麝香草酚顯著降低了氨氮濃度；而在連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中恒定條件下培養(yǎng)6 d后，與對照組相比，各麝香草酚添加組(5、50和500 mg/L)氨氮濃度均無顯著差異；他認(rèn)為這是由于瘤胃微生物將植物精油的活性成分鈍化為惰性物質(zhì)，批次培養(yǎng)的試驗時間不足以完全說明植物精油的作用效果，可能是試驗后期瘤胃微生物對麝香草酚有了一定的抗性和適應(yīng)性，導(dǎo)致瘤胃微生物菌群的改變，也可能是植物精油在試驗后期被瘤胃微生物降解利用。本次試驗中，綿羊在每期試驗中連續(xù)飼喂牛至油12 d，可能會導(dǎo)致牛至油活性成分被鈍化或試驗后期微生物菌群改變。綜上所述，牛至油對瘤胃氮代謝的影響效果會由于活性成分不同而不同，此外，試驗裝置、飼糧類型、添加水平和主要成分都會影響作用效果。

4 結(jié) 論

在本試驗條件下，綜合各項指標(biāo)得出，0.015%～0.045%牛至油對飼糧營養(yǎng)物質(zhì)的瘤胃降解率無顯著影響，對綿羊瘤胃液氮濃度無顯著影響，會影響瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸濃度，0.015%牛至油會降低瘤胃內(nèi)乙酸比例，添加效果最好。