朱 飛 蘇 娣 冉 雷 范彩云 張子軍 劉政權(quán) 宛曉春* 程建波*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實驗室，合肥230036)

茶渣是茶飲料、速溶茶和茶單寧(TTN)產(chǎn)業(yè)等加工茶葉后產(chǎn)生的殘渣，據(jù)統(tǒng)計，僅茶飲料和速溶茶公司每年產(chǎn)生的茶渣就高達(dá)16萬t。研究報道，茶渣的粗蛋白質(zhì)(CP)含量為26%～35%，是一種良好的蛋白質(zhì)飼料資源[1]，但茶渣中的TTN是一種具有澀味的抗?fàn)I養(yǎng)因子，會抑制動物對飼料的攝入[2]，其含有的酚羥基能螯合飼料中的鐵、銅和鋅等金屬元素以及蛋白質(zhì)，形成大分子金屬-單寧和蛋白質(zhì)-單寧螯合物，降低腸道對金屬元素和氮的吸收利用率[3-4]，TTN還能以非競爭性方式抑制胰α-淀粉酶的活性，從而影響動物對淀粉的消化吸收[5]。除此之外，機(jī)體吸收單寧后還會引起肝毒性和腎毒性，對于反芻動物而言，TTN不僅可以與瘤胃微生物細(xì)胞外酶反應(yīng)，還能與微生物細(xì)胞壁結(jié)合，使微生物失去生長所需的底物，并抑制氧化磷酸化和電子傳遞，從而破壞瘤胃微生物區(qū)系穩(wěn)態(tài)[4]。這些因素均限制了茶渣在動物飼料中的廣泛應(yīng)用，通常被當(dāng)作工業(yè)廢料丟棄，造成資源的巨大浪費(fèi)。預(yù)計到2020年，我國蛋白質(zhì)飼料資源缺口將達(dá)到4 800萬t，在此窘境下，科學(xué)工作者開始關(guān)注糟渣類飼料資源的開發(fā)與利用，并獲得了較高質(zhì)量的生物飼料資源。目前，我國對茶渣的利用主要集中在功能性成分提取[6]、栽培食用菌[7]和制備有機(jī)肥[8]等方面，國外則注重在環(huán)境治理中的應(yīng)用，例如使用茶渣去除廢水中重金屬離子[9]和有機(jī)污染物[10]以及吸附有害氣體[11]等，但將茶渣飼料化的研究并不多見。

黑曲霉(Aspergillusniger,AN)作為一種大型真菌，具有生長旺盛、發(fā)酵周期短且不產(chǎn)生毒素等特點(diǎn)，是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)證的安全菌種之一，可分泌淀粉酶、纖維素酶、植酸酶等酶類[12]，部分AN還可分泌單寧酶[13-14]。本試驗以AN為發(fā)酵菌種，期望利用AN產(chǎn)生的單寧酶和纖維素酶降解TTN和纖維素，在降低茶渣中TTN含量的同時有效提高CP含量，緩解茶渣的飼喂限制因素，開發(fā)出一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料資源，這將為開發(fā)利用茶渣飼料資源探索出一條新途徑，有效解決廢棄茶渣對環(huán)境造成的巨大壓力和緩解人畜爭糧的尖銳矛盾，具有重要的研究價值和良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗原料

茶渣：由浙江銘皇生物科技有限公司提供，TTN含量為13.30%，CP含量為32.30%。玉米粉：市場購買，CP含量為6.65%。

1.1.2 發(fā)酵菌種及培養(yǎng)基

AN由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)保藏，編號為41125。AN所用培養(yǎng)基為察氏培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 AN的活化及孢子液的制備

將AN凍干粉溶于液體培養(yǎng)基，再涂布到固體培養(yǎng)基上，于33 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至培養(yǎng)基表面鋪滿孢子，用液體培養(yǎng)基沖洗孢子獲得AN孢子懸液，用滅菌擦鏡紙過濾后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 接種量的計算

在將AN孢子懸液接入茶渣發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵之前，用血球計數(shù)板法調(diào)節(jié)AN孢子懸液濃度為1.25×107個/mL，接種量以每克發(fā)酵底物干重所接種的孢子量表示，茶渣發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量包含接入的菌液。

1.2.3 茶渣發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

按比例將茶渣和玉米粉(共50 g)在500 mL錐形瓶中混勻，然后倒入含有一定體積孢子懸液的純水，用玻璃棒攪拌均勻后以8層無菌紗布封口。

1.3 單因素優(yōu)化發(fā)酵條件試驗

在自然pH的條件下，考察玉米粉含量、料水比(m/V)、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響。以TTN和CP含量為測定指標(biāo)，篩選出發(fā)酵效果較好的單因素水平，以此進(jìn)行后一個單因素試驗研究，每個水平3個重復(fù)。

1.3.1 玉米粉含量對發(fā)酵效果的影響

設(shè)置玉米粉含量分別為0、5%、10%、15%和20%，料水比為1.0∶1.0、接種量為1.50×106個/g、發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵時間為4 d。

1.3.2 料水比對發(fā)酵效果的影響

在1.3.1確定的玉米粉含量下，設(shè)置料水比分別為1.0∶0.8、1.0∶1.0、1.0∶1.2、1.0∶1.4和1.0∶1.6，其他條件同1.3.1。

1.3.3 接種量對發(fā)酵效果的影響

在1.3.2確定的料水比下，設(shè)置接種量分別為1.25×105、2.50×105、5.00×105、1.00×106和1.50×106個/g，其他條件同1.3.2。

1.3.4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵效果的影響

在1.3.3確定的接種量下，設(shè)置恒溫培養(yǎng)箱的溫度分別為21、24、27、30、33、36和39 ℃，其他條件同1.3.3。

1.3.5 發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響

在1.3.4確定的發(fā)酵溫度下，設(shè)置發(fā)酵時間分別為2、3、4、5、6、7、8和9 d，其他條件同1.3.4。

1.4 正交優(yōu)化發(fā)酵條件試驗

以TTN和CP含量為測定指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇料水比、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間4個因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(表1)，以優(yōu)化發(fā)酵條件。

1.5 指標(biāo)測定

發(fā)酵產(chǎn)物105 ℃烘干，粉碎后過40目篩。CP、粗脂肪(EE)、粗灰分(Ash)、鈣(Ca)和磷(P)含量的測定參照張麗英[15]的方法；中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量的測定參照Van Soest等[16]的方法；TTN含量的測定參照GB/T 8313—2002[17]的方法，真蛋白質(zhì)(TP)含量的測定參照胡艷麗等[18]的方法，氨基酸(AA)含量采用氨基酸自動分析儀(日立L-8900)測定。

表1 L9(34)正交試驗設(shè)計

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2007進(jìn)行預(yù)處理，然后采用SAS 9.2進(jìn)行統(tǒng)計分析。單因素試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，再結(jié)合Duncan氏法進(jìn)行多重比較；正交試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析。P<0.05表示差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素優(yōu)化發(fā)酵條件試驗結(jié)果

2.1.1 玉米粉含量對發(fā)酵效果的影響

由表2可知，當(dāng)玉米粉含量為5%時，TTN含量降至最低，為2.17%，顯著低于其他玉米含量組(P<0.05)，同時TTN降解率最高，為81.34%，之后TTN降解率隨著玉米粉含量的增多而逐漸降低；CP含量隨著玉米粉含量的增多而逐漸降低，但CP增長率逐漸升高，說明玉米粉過量添加有利于CP含量的提高，但是不利于AN對TTN的降解。綜合考慮，選擇在茶渣中添加5%的玉米粉作為最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成。

2.1.2 料水比對發(fā)酵效果的影響

由表3可知，TTN含量隨著培養(yǎng)基水分含量的增多而呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，當(dāng)料水比為1.0∶1.4時，TTN含量降至最低，為2.74%，顯著低于其他組(P<0.05)；料水比在1.0∶(1.2～1.6)時，CP含量差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于料水比為1.0∶0.8時(P<0.05)，當(dāng)料水比為1.0∶1.4時,CP含量達(dá)到最高，為37.94%。綜合考慮TTN和CP含量以及發(fā)酵產(chǎn)物的烘干成本，選擇1.0∶1.4為最佳料水比。

表2 玉米粉含量對茶渣營養(yǎng)價值的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

降解率(%)=100×(對照組-發(fā)酵組)/對照組；增長率或提高率(%)=100×(發(fā)酵組-對照組)/對照組。表8和表9同。

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

Degradation rate (%)=100×(control group-fermentation group)/control group; increase rate or improvement rate (%)=100×(fermentation group-control group)/control group. The same as Table 8 and Table 9.

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

表3 料水比對茶渣營養(yǎng)價值的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。表4至表6同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 4 to Table 6.

2.1.3 接種量對發(fā)酵效果的影響

由表4可知，接種量為5.00×105和1.00×106個/g時TTN含量相對較低，其中5.00×105個/g組的TTN含量為3.75%，顯著低于除1.00×106個/g組外的其他各組(P<0.05)；CP含量隨著接種量的增加而升高，當(dāng)接種量為1.00×106個/g時，CP含量達(dá)到最高，為37.88%。5.00×105個/g組和1.00×106個/g組的TTN含量差異不顯著(P>0.05)，且1.00×106個/g組的CP含量顯著高于5.00×105個/g組(P<0.05)。綜合考慮，選擇1.00×106個/g的接種量為最佳接種量。

表4 接種量對茶渣營養(yǎng)價值的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.1.4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵效果的影響

由表5可知，TTN含量隨著發(fā)酵溫度的升高而逐漸降低，在36 ℃時達(dá)到最佳，僅為2.96%，顯著低于其他溫度組(P<0.05)；CP含量則與發(fā)酵溫度呈正相關(guān)，當(dāng)發(fā)酵溫度在36～39 ℃時，CP含量顯著高于其他溫度組(P<0.05)，并在36 ℃時達(dá)到最高，為38.50%。因此，選擇36 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

表5 發(fā)酵溫度對茶渣營養(yǎng)價值的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.1.5 發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響

由表6可知，TTN含量隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸降低，發(fā)酵時間為8、9 d時的TTN含量分別為1.81%、1.84%，顯著低于其他時間組(P<0.05)；CP含量隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸升高，發(fā)酵時間為7、8 d時的CP含量分別為43.28%和43.21%，顯著高于其他時間組(P<0.05)。綜合考慮TTN和CP含量以及發(fā)酵成本，最終確定8 d為最佳發(fā)酵時間。

2.2 正交優(yōu)化發(fā)酵條件試驗結(jié)果

由極差分析(表7)可知，各因素TTN降解產(chǎn)生影響的順序為C>D>B>A，即影響茶渣發(fā)酵降解TTN的因素依次為發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量、料水比。由TTN含量的K值可得最佳組合為A3B2C3D2，即料水比1.0∶1.5、接種量1.00×106個/g、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間8 d。由極差分析(表7)可知，各因素對CP含量產(chǎn)生影響的順序為C>A>D>B，即影響茶渣發(fā)酵提高CP含量的因素依次為發(fā)酵溫度、料水比、發(fā)酵時間、接種量。由CP含量的K值可知，提高CP含量的最佳組合為A2B3C3D2，即料水比1.0∶1.4、接種量1.25×106個/g、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間8 d。

結(jié)合單因素試驗結(jié)果得出，茶渣發(fā)酵的最佳組合為A2B2C3D2，即料水比1.0∶1.4、接種量1.00×106個/g、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間8 d。

表6 發(fā)酵時間對茶渣營養(yǎng)價值的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表7 正交試驗結(jié)果的極差分析表(干物質(zhì)基礎(chǔ))

K1、K2、K3分別代表結(jié)果在水平1、2、3下的平均值。R代表K1、K2、K3在各因素下的極差。

K1, K2and K3stand for the mean value of the results under levels 1, 2 and 3, respectively. R stands for the range of K1, K2and K3under each factor.

2.3 正交試驗發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)價值分析

采用最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，獲得最佳發(fā)酵產(chǎn)物，茶渣發(fā)酵前后營養(yǎng)價值和AA含量變化分別見表8和表9。

由表8可知，AN發(fā)酵可有效提高茶渣的營養(yǎng)價值。與對照組相比，經(jīng)AN發(fā)酵后茶渣的CP含量由31.22%提高到44.56%(P<0.05)，TP含量由23.64%提高到36.99%(P<0.05)，TTN含量由11.63%降低到2.42%(P<0.05)，NDF含量由39.85%降低到32.96%(P<0.05)，ADF含量由15.70%降低到12.28%(P<0.05)，EE含量由4.06%提高到5.13%(P<0.05)，Ash含量由4.09%提高到6.09%(P<0.05)，Ca含量由0.75%提高到1.10%(P<0.05)，P含量由0.32%提高到0.47%(P<0.05)。

由表9可知，與對照組相比，經(jīng)AN發(fā)酵后茶渣中17種AA的含量均顯著提高(P<0.05)，且總AA含量由18.45%提高到23.38%，提高率為26.72%。必需AA中的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸和賴氨酸的提高率分別為42.01%、25.27%、22.50%、26.20%、30.00%、31.20%和24.62%，其中纈氨酸提高率位居17種AA提高率的榜首。

表8 茶渣發(fā)酵前后營養(yǎng)價值變化(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表9 茶渣發(fā)酵前后AA含量變化(干物質(zhì)基礎(chǔ))

3 討 論

研究表明，菌種、培養(yǎng)基組成、料水比和原料粒度、發(fā)酵溫度、菌液接種量和發(fā)酵時間等因素會影響發(fā)酵進(jìn)程[19]。對于固態(tài)發(fā)酵而言，水分和原料粒度影響著好氧發(fā)酵的氣體交換過程。適宜的水分和原料粒度能夠保證發(fā)酵基質(zhì)深層微生物對氧氣的需求，疏松多孔的基質(zhì)狀態(tài)還能使得微生物的代謝廢物及時排出，基質(zhì)內(nèi)部的養(yǎng)分也可隨著自由水通過原料間隙擴(kuò)散到基質(zhì)表面，滿足基質(zhì)表面微生物對營養(yǎng)的需求，有利于微生物正常繁殖并保持高產(chǎn)酶活性狀態(tài)[20]。此外，水能夠溶解發(fā)酵產(chǎn)生的氨態(tài)氮和蛋白質(zhì)分解物，并能與蛋白質(zhì)的正電荷或者負(fù)電荷相互作用，增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[21]，從而減少氮損失，提高CP含量。本試驗發(fā)現(xiàn)1.0∶1.4的料水比可使TTN含量降為最低，間接表明在此料水比下單寧酶產(chǎn)量最高。Yee等[22]研究原料粒度和含水量對AN發(fā)酵樹皮生產(chǎn)單寧酶的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.0∶1.5的初始料水比可獲得最佳單寧酶產(chǎn)量，此結(jié)果與本試驗所得最佳料水比相似。Mahdi等[23]發(fā)現(xiàn)AN Ass19發(fā)酵麩皮時最大單寧酶產(chǎn)量對應(yīng)的料水比為1∶3，高于本試驗結(jié)果，可能的原因是AN類型和發(fā)酵底物以及底物初始含水率與本試驗不同。

溫度極易影響菌體中核酸與蛋白質(zhì)等重要成分的生理功能，過低的溫度會抑制微生物體內(nèi)酶的活性，降低繁殖效率，過高的溫度則會損傷菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，可能直接殺死微生物[24]。另外，AN等真菌的適宜生長溫度較為寬泛，一般在20～55 ℃的溫度范圍內(nèi)都可以生存，但不同溫度下真菌的產(chǎn)酶能力和產(chǎn)酶種類會有所不同，因此需要根據(jù)試驗?zāi)康倪x擇合適的發(fā)酵溫度[25]。本試驗的目的是利用AN產(chǎn)單寧酶，進(jìn)而降解茶渣中的TTN，研究發(fā)現(xiàn)36 ℃時TTN含量降為最低且CP含量最高，表明此溫度下單寧酶產(chǎn)量最佳且AN生長菌絲最多。湯小朋[25]發(fā)現(xiàn)AN發(fā)酵木薯渣時羧甲基纖維素酶活性和CP含量在36 ℃時為最高，與本試驗結(jié)果一致，說明羧甲基纖維素酶在36 ℃時具有最大產(chǎn)量，這可能也是本試驗中茶渣發(fā)酵后ADF和NDF含量降低的原因。Aboubakr等[26]將AN的發(fā)酵溫度從30 ℃提高到35 ℃，發(fā)現(xiàn)單寧酶活性從6.100 U/mL提升到6.254 U/mL，說明35 ℃更有利于AN產(chǎn)單寧酶，與本試驗所得最佳發(fā)酵溫度接近。

微生物的接種量和發(fā)酵時間會影響發(fā)酵工業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。較低的接種量不僅會減緩發(fā)酵進(jìn)程，增加雜菌污染的概率，還會延長發(fā)酵時間，增加發(fā)酵成本；過高的接種量雖然能夠降低雜菌污染的可能性，但微生物在短時間內(nèi)會大量擴(kuò)增繁殖，在造成底物中代謝副產(chǎn)物過量積聚，反饋抑制微生物的生長速度與產(chǎn)酶能力的同時還會引起培養(yǎng)基消耗過快且黏度增加，不利于氧的擴(kuò)散，反而加速細(xì)胞凋亡，影響產(chǎn)物的合成和降低發(fā)酵效率[24]。因此，必須選擇合適的接種量，以使微生物既能抵抗雜菌污染，正常繁殖、產(chǎn)酶，還能縮短發(fā)酵時間，從而提高發(fā)酵效益。本試驗發(fā)現(xiàn)AN發(fā)酵茶渣的最優(yōu)接種量為1.00×106個/g，與趙華等[27]研究得出的AN發(fā)酵甘薯渣的最佳接種量一致，但其發(fā)酵時間要短于本試驗所得最佳發(fā)酵時間，可能是由于甘薯渣的營養(yǎng)價值要遠(yuǎn)低于茶渣，微生物的生長提前結(jié)束。Wang等[28]利用AN發(fā)酵茶梗獲取單寧酶，其最佳接種量為4×107個/g，菌種類型、發(fā)酵溫度以及底物組成不同可能是導(dǎo)致其所得最佳接種量是本試驗所得最佳接種量40倍的原因。

本試驗中，茶渣經(jīng)過AN發(fā)酵后，NDF和ADF含量分別降低了17.29%和21.78%，與張玉誠[29]研究白酒糟發(fā)酵和唐慶鳳等[30]研究木薯渣發(fā)酵的結(jié)果相似；Ash、Ca和P含量分別提高了48.90%、46.67%和46.88%，與湯小朋[25]和張玉誠[29]的研究結(jié)果相似；EE含量提高了26.35%，與湯小朋[25]的研究結(jié)果變化趨勢一致；TP含量提高了56.47%，與張玉誠[29]的研究結(jié)果相似。AN在利用茶渣和玉米粉中的碳源、氮源及其他營養(yǎng)因子進(jìn)行自身生長與代謝的過程中，也能產(chǎn)生纖維素酶和淀粉酶等酶類，將纖維素、淀粉等碳水化合物分解為二氧化碳和水，二氧化碳和部分水分逸散，其余水分和氮源將被微生物利用合成菌體蛋白，這樣就使得原料中的NDF、ADF和DM含量降低，CP、TP、EE、Ash、Ca和P含量相應(yīng)升高，但茶渣和玉米粉的營養(yǎng)價值絕對含量保持不變或者略有降低。本試驗中17種AA在茶渣和發(fā)酵茶渣中均有分布，但茶渣經(jīng)AN發(fā)酵后，17種AA含量均顯著提高，且必需AA中的纈氨酸提高率最高，說明經(jīng)微生物發(fā)酵后，發(fā)酵產(chǎn)物的AA含量會有所增加，這與歐榮娣[24]和張玉誠[29]的結(jié)果相似。茶渣經(jīng)AN發(fā)酵后EE含量提高的另一個可能原因是AN將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂肪[25]。總體而言，AN在發(fā)酵茶渣的過程中會降解TTN，同時積累大量菌體蛋白和代謝產(chǎn)物，從而提高茶渣的營養(yǎng)價值。

4 結(jié) 論

① 以AN發(fā)酵茶渣，最佳工藝為玉米粉含量5%、料水比1.0∶1.4、接種量1.00×106個/g、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間8 d、自然pH。

② 在最佳發(fā)酵工藝下經(jīng)AN發(fā)酵后，茶渣的CP、TP、EE、Ash、Ca、P和17種AA含量顯著提高，TTN、NDF和ADF含量顯著下降。