范妤 郭東艷 宋強(qiáng) 王晶 程江雪

1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046 2. 陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712046 3. 陜西省核工業(yè)215醫(yī)院，陜西 咸陽 712000

骨質(zhì)疏松多見于絕經(jīng)期后女性，卵巢功能減退后體內(nèi)雌激素水平降低，導(dǎo)致破骨細(xì)胞活躍增強(qiáng)是其主要原因，骨吸收大于骨形成，骨轉(zhuǎn)換增速，骨結(jié)構(gòu)的動態(tài)平衡被破壞，骨量迅速丟失導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，表現(xiàn)為骨密度降低，骨微結(jié)構(gòu)退化，骨量減少，骨脆性增加[1]。目前臨床治療多選用雌激素替代療法，口服戊酸雌二醇等藥物補(bǔ)充雌激素的分泌不足，但長期服用存在子宮出血、乳腺癌及心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。中醫(yī)理論認(rèn)為，腎主骨生髓，腎精虧虛，骨髓生化無源，骨失其養(yǎng)是骨質(zhì)疏松癥的主要病機(jī)，治療上多采用溫補(bǔ)腎陽，填精補(bǔ)髓，養(yǎng)血活血的治則，療效顯著[2]。生地黃湯出自唐代孫思邈《千金方》，由生地黃、大黃兩味藥組成，具有滋陰補(bǔ)腎、化瘀止血功效。有研究報(bào)道，生地黃具有雌激素樣作用，通過誘導(dǎo)激活雌激素受體發(fā)揮雌激素樣活性[3]；大黃能夠提升成年大鼠血清雌激素水平[4-5]。但生地黃湯對由于卵巢早衰雌激素水平降低誘發(fā)骨質(zhì)疏松的保護(hù)作用卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立雷公藤多苷誘導(dǎo)的卵巢早衰大鼠模型，研究生地黃湯對卵巢早衰大鼠骨代謝的影響，為擴(kuò)大生地黃湯的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

8 W齡雌性成年SD大鼠，體質(zhì)量250±20 g，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號SYXK-R(陜)2012-003。室溫飼養(yǎng)，不禁食不禁水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

雷公藤多甙片購自湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司，批號20131102；戊酸雌二醇 (補(bǔ)佳樂)購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號17OA。

雌二醇(E2)、孕酮(P)放免試劑盒，購于北京北方生物技術(shù)研究所；鈣測試盒、磷測試盒，購自南京建成生物工程研究所；大鼠堿性磷酸酶ELISA試劑盒、大鼠骨堿性磷酸酶ELISA試劑盒、大鼠1,25(OH)2D3ELISA試劑盒，均購自上海酶科生物科技有限公司。

1.3 儀器

Centrifuge 5417R臺式冷凍高速離心機(jī)，德國艾本德公司；BIO-RAD Model680酶標(biāo)儀，北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司；科研級光學(xué)顯微鏡，德國蔡司公司。

1.4 生地黃湯的制備

按照處方比例稱取生地黃1 200 g，大黃40 g，加10倍量20%乙醇浸漬提取36 h，濾過，濾液減壓濃縮至每毫升相當(dāng)于原藥材2 g，即得。

1.5 研究方法

1.5.1卵巢早衰大鼠模型的建立及分組：采用口服雷公藤多甙片建立成年雌性大鼠卵巢早衰模型[6]。48只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為6組，即：空白組、模型組、陽性對照組、生地黃湯高、中、低劑量組，每組8只?？瞻捉M大鼠正常飼養(yǎng)，其余各組每日灌胃給于雷公藤多甙片(75 mg/kg),連續(xù)造模14 d。從第15 d起，模型組灌胃生理鹽水(2 mL/kg)；陽性對照組灌胃補(bǔ)佳樂(1 mg/kg)；生地黃湯高、中、低劑量組灌胃(12、6、3 g/kg)。每日1次，連續(xù)給藥21天。

1.5.2取材:末次給藥后禁食不禁水，16 h后水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，室溫靜置2 h后，4 ℃離心，分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3觀察大鼠動情周期:自灌胃雷公藤多甙造模第1天起，每隔2天，均在早晨固定時(shí)間用棉簽蘸取各組大鼠陰道脫落上皮，制做涂片，HE染色后，觀察動情周期變化，判斷大鼠卵巢早衰模型制備情況。

1.5.4血清性激素水平檢測:采用放射免疫法測定血清中雌激素 (E2)、孕酮(P)的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.5.5血清鈣(Ca)、磷(P)的檢測: 比色法檢測血清中鈣、磷的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.5.6血清堿性磷酸酶(ALP)、骨堿性磷酸酶(BALP)、1,25二羥基維生素D3(1,25(OH)2D3)的檢測:ELISA法檢測血清中ALP、BALP、1,25(OH)2D3含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 對卵巢早衰大鼠動情周期的影響

空白組大鼠的動情周期較為規(guī)律，為3～5 d，造模14 d，與空白組比較，其余各組大鼠動情周期均不同程度延長，約6～8 d，且周期變化紊亂，表明卵巢受損，功能受到抑制。經(jīng)生地黃湯灌胃治療21 d后，各組大鼠動情周期縮短，為4～6 d，各時(shí)期穩(wěn)定并順序出現(xiàn)。

2.2 對卵巢早衰大鼠血清性激素水平的影響

陽性對照組和生地黃湯治療組均能升高卵巢早衰大鼠血清E2，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。陽性對照組和生地黃湯高劑量組能夠促進(jìn)大鼠血清中P水平升高，與模型組比較差異顯著(P<0.05)，但生地黃湯中、低劑量組血清中P水平與模型組比較無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 生地黃湯對卵巢早衰大鼠血清性激素水平的影響Table 1 Effect of raw radix rehmanniae decoction on serum sex hormone levels in rats with premature ovarian failure

2.3 對血清鈣、磷含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清鈣、磷含量降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.05)；與模型組對比，陽性對照組、生地黃湯高、中劑量治療組，血清鈣含量升高(P<0.05)；與模型組比較，生地黃湯高劑量組血清磷含量升高(P<0.05)，中、低劑量組差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 生地黃湯對卵巢早衰大鼠血清鈣、磷含量的影響Table 2 Effect of raw radix rehmanniae decoction on serum calcium and phosphorus in rats with premature ovarian failure

2.4 對卵巢血清堿性磷酸酶(ALP)、骨堿性磷酸酶(BALP)、1,25二羥基維生素D3(1,25(OH)2D3)含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清中ALP、BALP活力增強(qiáng)；與模型組比較，陽性對照組、生地黃湯高、中劑量治療組ALP、BALP活力降低，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較，模型組大鼠血清中1,25(OH)2D3含量降低，與模型組比較，陽性對照組和生地黃湯各劑量治療組1,25(OH)D3含量顯著升高(P<0.01)。見表3。

表3 生地黃湯對卵巢早衰大鼠血清ALP活力、BALP含量及1,25(OH)2D3含量的影響Table 3 Effect of raw radix rehmanniae decoction on ALP, BALP, and 1,25(OH)2D3 content in serum with premature ovarian failure rats

3 討論

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP) 是一種以骨量降低及骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加的代謝性骨病[7]。多種病因所致的卵巢早衰患者，卵巢功能過早衰竭導(dǎo)致合成分泌雌激素能力下降，長期的低雌激素狀態(tài)常常會增加骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。植物雌激素研究近年為人們所重視，植物雌激素是體內(nèi)存在的一類甾體化合物，多以雌酮、雌二醇、雌三醇等形式存在，其中雌二醇生理功能最強(qiáng)。大量研究報(bào)道顯示，植物雌激素作用溫和，能夠有效減輕女性絕經(jīng)期癥狀，預(yù)防骨質(zhì)疏松，同時(shí)降低出血、血栓、生殖系統(tǒng)腫瘤等常見并發(fā)癥的發(fā)病率[8-9]。本研究采用灌胃雷公藤多甙片建立成年雌性大鼠卵巢早衰模型，觀察生地黃湯對卵巢早衰所致骨質(zhì)疏松的治療作用。

大鼠陰道上皮細(xì)胞形態(tài)及類型可隨體內(nèi)卵巢激素的周期性變化而改變，動態(tài)觀察動情周期能夠直接反映大鼠性腺功能，是檢測卵巢功能狀態(tài)的直接標(biāo)志之一，灌胃雷公藤多甙片14 d，模型大鼠均出現(xiàn)動情周期紊亂、延長，表明大鼠卵巢功能損傷，卵巢早衰模型建立成功，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[6]。有文獻(xiàn)顯示，生地黃具有雌激素樣作用，大黃能夠升高成年大鼠血清雌激素水平[4-5]，本實(shí)驗(yàn)中，灌胃給予卵巢早衰大鼠補(bǔ)佳樂和生地黃湯治療后，大鼠血清雌激素、孕激素水平均升高，生地黃湯高劑量治療組大鼠孕激素水平與補(bǔ)佳樂組最為接近，顯示生地黃湯能夠提高體內(nèi)雌激素、孕激素水平,發(fā)揮類雌激素樣作用。實(shí)驗(yàn)中生地黃湯中、低治療組大鼠血清孕激素含量有升高，但與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與生地黃湯治療時(shí)間較短、給藥劑量較小有關(guān)。

骨質(zhì)由有機(jī)成分和鈣鹽構(gòu)成，其中有機(jī)成分由膠原纖維和多種粘連蛋白構(gòu)成，約占骨干重的35%；鈣鹽以鈣、磷結(jié)合形成羥基磷酸鹽的形式存在[10]，約占骨干重65%。檢測血液中鈣、磷含量是反映骨代謝狀態(tài)的重要依據(jù)。在實(shí)驗(yàn)中，卵巢早衰模型組大鼠血清鈣、磷含量顯著降低，表明骨質(zhì)中羥基磷酸鹽沉積減少，給予補(bǔ)佳樂和高劑量生地黃湯治療后，大鼠血液中鈣、磷含量均顯著增加，表明生地黃湯可通過發(fā)揮類雌激素樣作用，調(diào)節(jié)骨組織中鈣的儲存與釋放，改善骨組織中鈣、磷代謝，促進(jìn)骨鈣沉積。

ALP是骨標(biāo)記性蛋白之一，成骨細(xì)胞分化成熟時(shí)可分泌ALP增多，參與骨的礦化，ALP 活性高低可以特異性反映成骨細(xì)胞的分化程度；BALP是成骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外酶，在多糖肌醇磷酸特異水解酶的作用下, BALP被釋放到外周血，通過水解磷酸鹽和焦磷酸鹽，促進(jìn)釋放的磷酸根與鈣沉積在膠原骨架上，利于骨的礦化，同時(shí)也能夠降低對骨鹽形成的抑制作用，促進(jìn)成骨過程，是骨形成標(biāo)志物[11-12]。有研究顯示，骨質(zhì)疏松發(fā)生早期，BALP含量即發(fā)生改變，且因此可將其作為骨質(zhì)疏松早期診斷和療效檢測的重要指標(biāo)之一[13]。本研究顯示，模型組大鼠血清中ALP 和BALP均顯著升高，表明卵巢早衰發(fā)生時(shí)，骨鹽分解增加，形成被抑制，骨代謝紊亂，骨質(zhì)疏松發(fā)生。經(jīng)補(bǔ)佳樂和生地黃湯治療后，血清中ALP 和BALP活性下降，與血液中的鈣離子相互作用，共同促進(jìn)鈣、磷在骨中的沉積，加速骨質(zhì)合成過程。

1,25(OH)2D3是機(jī)體活力最強(qiáng)的維生素 D代謝產(chǎn)物[14],在骨代謝中發(fā)揮重要作用，其既能夠增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性，增加ALP的表達(dá)，促進(jìn)骨的礦化和形成，也能夠促進(jìn)處于成熟后期成骨細(xì)胞分泌I型膠原蛋白，改善骨的質(zhì)與量。因此血清中ALP、1,25(OH)2D3的含量能夠反映當(dāng)前骨轉(zhuǎn)化狀態(tài)，可用于評價(jià)干預(yù)藥物的療效[15-16]。本實(shí)驗(yàn)中，卵巢早衰模型大鼠灌胃生地黃湯治療后，血清中ALP活力降低，1,25(OH)2D3含量升高，表明生地黃湯可增強(qiáng)卵巢早衰大鼠成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)血鈣沉積于骨，同時(shí)減少骨鈣的釋放，改善骨質(zhì)疏松狀態(tài)。

綜上所述，本研究顯示生地黃湯具有類雌激素樣作用，可以通過升高卵巢早衰大鼠血清雌二醇與孕激素水平，改善卵巢功能。在此基礎(chǔ)上，生地黃湯通過調(diào)節(jié)ALP、BALP活力，增加1,25(OH)2D3含量，增強(qiáng)骨組織中成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)血中游離鈣、磷在骨質(zhì)中沉積，使骨形成大于骨吸收，調(diào)節(jié)骨代謝平衡，改善由卵巢早衰引發(fā)的骨質(zhì)疏松。但由于卵巢功能衰退引發(fā)的骨質(zhì)疏松癥機(jī)制復(fù)雜且尚不明確，本實(shí)驗(yàn)研究還可從對成骨細(xì)胞膜雌激素受體的表達(dá)的影響等方面探究生地黃湯的作用機(jī)制，并通過增加樣本量，減小組內(nèi)誤差等方面對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，為生地黃湯防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松提供新思路。