沈俊逸 方邦江 趙智明 劉春麗 壯雨雯 徐文俊 蔡 輝#

1 中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 江蘇 南京 210002

2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 上海 200032

糖尿病并發(fā)腦梗死是糖尿病最常見的血管并發(fā)癥[1]。目前，糖尿病腦梗死的發(fā)病機(jī)制及有效防治成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。糖尿病腦梗死患者長(zhǎng)期處于高血糖的狀態(tài)，微血管稀疏化、側(cè)枝化能力降低，梗死區(qū)域長(zhǎng)期血供不足，神經(jīng)功能恢復(fù)差。我們以往研究結(jié)果提示，糖尿病腦梗死大鼠基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）、CXC類趨化因子受體 4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4）表達(dá)下降，使得血管內(nèi)皮祖細(xì)胞減少，其增殖、黏附、遷移能力降低，復(fù)元醒腦湯通過(guò)顯著上調(diào)糖尿病腦梗死大鼠缺血腦組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）蛋白的表達(dá)，可以促進(jìn)血運(yùn)的重建[2-3]。但在研究中我們對(duì)SDF-1/CXCR4軸信號(hào)通路進(jìn)行阻斷后發(fā)現(xiàn)，缺血腦組織區(qū)域依然有部分血管新生和血運(yùn)重建的發(fā)生，這提示糖尿病腦梗死后血管新生尚存在其他調(diào)控途徑和機(jī)制。腦梗死的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后轉(zhuǎn)歸與糖尿病患者的血糖水平密切相關(guān)[4]。microRNAs是一種可以與其靶mRNA分子結(jié)合，抑制相關(guān)靶基因和蛋白表達(dá)的小RNA。研究證實(shí)，microRNA-503可以動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)血糖的平衡，microR-503能夠通過(guò)與靶向的mRNA（CCNE1和CDC25A）互補(bǔ)配對(duì)，從而導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制，microR-503不僅能夠直接調(diào)控胰島素分泌量、胰島發(fā)育、胰島β細(xì)胞的分化情況等，而且還可以調(diào)節(jié)胰島素在靶組織中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及影響其功能的發(fā)揮，從而參與了對(duì)血糖的調(diào)節(jié)過(guò)程[5-6]。研究證實(shí)，通過(guò)上調(diào)細(xì)胞CCNE1和CDC25A蛋白，在一定程度上能夠抑制microR-503的表達(dá)，從而改善各種血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，避免其損傷的反生，并且能夠幫助微血管網(wǎng)絡(luò)形成，保證血液的正常循環(huán)[7]。

本研究以糖尿病腦梗死腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvascalar endothelial cell，BMEC）為研究對(duì)象，觀察復(fù)元醒腦湯［人參（單煎）、三七、水蛭各10g，石菖蒲12g，益母草30g，生南星15g，制大黃（后下）9g，濃度388g/L］以及microR-503抑制劑對(duì)其干預(yù)前后對(duì)靶基因的影響以及對(duì)BMEC細(xì)胞遷移和成管能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料：分述如下。

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：20只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量250g±25g，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［動(dòng)物合格證：SCXK(滬)2011-009］。

1.1.2 主要試劑及儀器：雙抗（P/S）、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)買于美國(guó)Gibco公司；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（ECM，1001）購(gòu)買于美國(guó)ScienCell公司；RNA抽提試劑（RNAiso Plus，9109）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript? RT Master Mix，RR036A）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（SYBR?Premix Ex Taq?，RR420A）購(gòu)買于Takara公司（大連寶生生物）；microRNA-503抑制劑、microRNA control抑制劑和Lipofectamine?RNAi MAX Transfection Reagent購(gòu)買于Thermo Fisher scientific公司；結(jié)晶紫（C6158）、Ⅱ型膠原酶（C1764）、鏈脲佐菌素（STZ，S0130）和MTS試劑購(gòu)買于美國(guó)sigma公司；Ⅷ因子子相關(guān)抗原(von willebrand factor，vwF)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(ab8822)；BD基質(zhì)膠Matrigel購(gòu)買于美國(guó)BD公司。酶標(biāo)分析儀（美國(guó)Thermo Fisher scientific公司,Multiscan go型），實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad公司，CFX 96型），細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司，311型）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法：分述如下。

1.2.1 BMEC分離：取健康雄性SD大鼠20只，參照文獻(xiàn)[8]制備糖尿病腦梗死大鼠模型。即用STZ制備糖尿病模型，線栓法制備腦梗死模型，根據(jù)Berderson評(píng)分（≥1）確定造模成功[9]。造模成功后，3%的戊巴比妥鈉(0.1ml/100g)腹腔注射麻醉，頸椎脫臼法處死；75%乙醇浸泡5min消毒，打開顱腔取出完整腦組織，置于預(yù)冷的PBS液中，漂洗3次，加入1ml DMEM/F12培養(yǎng)液，將大腦皮質(zhì)剪成體積約1mm3的小塊；加入0.1%Ⅱ型膠原酶，充分混勻后置于37℃水浴消化40min，1000g離心8min；取上清后加入20%BSA懸浮，充分混勻后1000g離心20min，將中上層神經(jīng)組織和大血管去除，僅保留沉淀；加入Ⅱ型膠原酶2ml，懸浮并充分混勻后置于37℃水浴消化40min，1000g離心8min，去掉上清液加入20%BSA懸浮，充分混勻，1000g離心20min，收集微紅色的微血管段。

1.2.2 BMEC的培養(yǎng)和鑒定：以內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM+10%FBS+1%P/S)重懸，接種于25ml培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。細(xì)胞以2×105/ml接種于24孔板中，3天后倒掉培養(yǎng)基，PBS洗滌，4%多聚甲醛室溫固定30min，用BMEC特異性Ⅷ因子鑒定抗體vwF孵育細(xì)胞（1∶100稀釋）4℃過(guò)夜，室溫PBST洗3次，DAPI染核，倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.2.3 空白血清和中藥血清制備：連續(xù)灌藥3天（根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，并依實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積比計(jì)算，每日按10.4g/kg/d，2次/d給以復(fù)元醒腦湯灌胃），第3天灌藥后1h，對(duì)灌藥大鼠取血，制備中藥血清；同時(shí)取未灌藥大鼠取血制備空白血清。除菌混合，滅活補(bǔ)體－20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 BMEC轉(zhuǎn)染microRNA-503抑制劑：BMEC以3×105/孔鋪于6孔板，分別給予5%空白血清和5%中藥血清培養(yǎng)24h后，Lipofect RNAiMAX試劑盒轉(zhuǎn)染microRNA抑制劑control和microRNA-503抑制劑60 pmol?？偣?組，空白血清+抑制劑control對(duì)照組，空白血清+microRNA-503抑制劑，中藥血清+抑制劑control組，中藥血清+microRNA-503抑制劑組。

1.2.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染24h后的BMECs消化計(jì)數(shù)后，以106個(gè)/ml的密度用無(wú)血清ECM培養(yǎng)基重懸，transwell小室加100μl細(xì)胞，下室加500μl含10%FBS及相應(yīng)空白血清或中藥血清的DMEM。遷移16h后，24孔transwell小室用0.1%結(jié)晶紫+10%甲醇顯色20min后，顯微鏡下觀察拍照后，用500μl每孔33%醋酸洗脫結(jié)晶紫，酶標(biāo)儀測(cè)OD560。

1.2.6 小管形成實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶消化，然后制成細(xì)胞懸液。將100μlatrigel加到培養(yǎng)皿中涂勻。混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中（24孔板）。將培養(yǎng)器皿在室溫下放置25min，待膠凝固后，加入1×106BMEC細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.7 BMECs中microRNA-503、CDC25A、CCNE1、基因表達(dá)水平檢測(cè)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，繼續(xù)培養(yǎng)48h，抽取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR）。引物序列如下：microRNA-503 F：CGCGGGATCGGGTCAGA，miR-503R：GGGAACATGTTGATCTCAG，U6 F：CTCGCTTCGGCAGCACA，U6 R:AACGCTTCACGAATTTGCGT，CDC25A F：GGGAATGAGCAGCCTCTTCTT，CDC25A R:ATCTCTACAAACCAGACCAGGG， CCNE1 F： ACAGCTAGCGCGGTGTAG， CCNE1R：GGACTTGGAACTCAGACCCG GAPDHF：ACTTTGGCATCGTGGAAGGG，GAPDH R：TGCAGGGATGATGTTCTGGG。PCR條件采用兩步法：98℃ 10s,58℃ 20s，40次循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，方差分析P值小于或等于0.05，用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 BMEC的分離培養(yǎng)和鑒定：BMEC的培養(yǎng)情況具體見圖1A，BMEC（200×）：細(xì)胞的形狀呈短梭形，單層生長(zhǎng)。高倍鏡下（圖1B）細(xì)胞形態(tài)更為清晰，細(xì)胞呈現(xiàn)梭形。通過(guò)Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光實(shí)驗(yàn)（圖2），對(duì)照組陰性細(xì)胞沒有被染色（圖2A），陽(yáng)性組（圖2B）可以觀察到實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)的BMEC的胞漿及細(xì)胞核周呈現(xiàn)綠色著色，說(shuō)明內(nèi)皮細(xì)胞純度可達(dá)90%以上。根據(jù)BMEC的培養(yǎng)觀察，BMEC陽(yáng)性純度效率、形態(tài)滿足實(shí)驗(yàn)需要。

圖1 白光下BMEC細(xì)胞形態(tài)

圖2 BMECⅧ因子免疫熒光鑒定

2.2 復(fù)元醒腦湯治療的大鼠血清對(duì)BMECs中microRNA-503的表達(dá)影響：我們?cè)诩?xì)胞水平中，以miR-503i作為陽(yáng)性對(duì)照，抑制microRNA-503的表達(dá)，通過(guò)定量PCR的表達(dá)檢測(cè)microRNA-503的表達(dá)量，觀察復(fù)元醒腦湯治療的大鼠血清是否可以有效抑制microRNA-503的表達(dá)，從而達(dá)到改善糖尿病腦梗死大鼠的治療效果。如表1所示，與microRNA control相比，microRNA-503抑制劑能明顯抑制microRNA-503的表達(dá)（P＜0.05）。2.3 復(fù)元醒腦湯具有促進(jìn)BMECs的遷移能力：將BMEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染microRNA抑制劑control、microRNA-503抑制劑24h后，重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。如圖3和表2顯示相對(duì)于空白血清對(duì)照組，復(fù)元醒腦湯中藥血清以及microRNA-503抑制劑組都可以明顯增強(qiáng)BMECs的遷移

能力（P＜0.05）。復(fù)元醒腦湯促進(jìn)BMEC遷移能力，進(jìn)一步說(shuō)明了復(fù)元醒腦湯通過(guò)抑制microRNA-503的表達(dá)從而達(dá)到促進(jìn)了BMEC的遷移能力。

表1 BMEC轉(zhuǎn)染microRNA-503抑制劑對(duì)microRNA-503表達(dá)的抑制作用（-x±s)

表2 酶標(biāo)儀檢測(cè)中藥血清對(duì)BMEC遷移能力的影響（-x±s)

圖3 中藥血清對(duì)BMEC遷移能力的影響

2.4 復(fù)元醒腦湯中藥血清對(duì)BMECs中microRNA-503以及CCNE1和CDC25A基因表達(dá)的影響：如表3所示microRNA-503抑制劑和復(fù)元醒腦湯中藥血清都可以明顯上調(diào)CCNE1和CDC25A的基因表達(dá)（P＜0.05），從而抑制了microRNA-503的表達(dá)（P＜0.05）。然而復(fù)元醒腦湯中藥血清的抑制作用沒有microRNA-503抑制劑明顯。但是，microRNA-503抑制劑和復(fù)元醒腦湯中藥血清聯(lián)合刺激，可以更加明顯地抑制microRNA-503的表達(dá)（P＜0.05），復(fù)元醒腦湯對(duì)BMEC遷移和增殖的促進(jìn)作用，是通過(guò)上調(diào)了CCNE1和CDC25A的表達(dá)，從而抑制了microRNA-503的表達(dá)，最終減輕了內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

表3 復(fù)元醒腦湯中藥血清對(duì)BMEC中microRNA-503以及CCNE1、CDC25A基因表達(dá)的影響（-x±s)

2.5 復(fù)元醒腦湯中藥血清促進(jìn)小管形成：我們利用BMEC進(jìn)行小管形成實(shí)驗(yàn)，對(duì)復(fù)元醒腦湯中藥血清在小管形成實(shí)驗(yàn)的修復(fù)作用進(jìn)行探討。如圖4A所示空白血清對(duì)照組的小管形成能力最弱；單純使用microRNA-503抑制劑（圖4B）或復(fù)元醒腦湯中藥血清（圖4C）對(duì)小管形成都有一定的促進(jìn)作用；聯(lián)合使用miRNA-503抑制劑和復(fù)元醒腦湯中藥血清（圖4D）能明顯促進(jìn)小管的形成。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，復(fù)元醒腦湯中藥血清可以通過(guò)促進(jìn)小管形成從而促進(jìn)血管損傷的恢復(fù)。

圖4 不同處理組對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞成管能力的影響

3 討論

在中醫(yī)學(xué)中，糖尿病合并腦梗死屬于消渴并發(fā)“中風(fēng)”，消渴總結(jié)為燥熱為標(biāo)、陰虛為本，中風(fēng)總結(jié)為虛、風(fēng)、火、氣、痰、血，主要表現(xiàn)為經(jīng)絡(luò)瘀血、肝腎陰虛以及氣血阻滯。因此，此癥乃是因?yàn)樵餆帷㈥幪摬⒋?，煉液為痰，而使得?jīng)脈阻斷，心竅被蒙蔽所致。治療本病的原理在于以扶持元?dú)鉃楦?，輔以化痰祛瘀、熄風(fēng)泄熱、醒腦開竅。因此在腦梗死的治療手段上痰瘀的消除起到關(guān)鍵決定性的作用，是中醫(yī)治療中風(fēng)的關(guān)鍵。自擬復(fù)元醒腦湯（人參、生天南星、石菖蒲、三七、水蛭、益母草、大黃）治療糖尿病腦梗死取得良好臨床療效。方中人參大補(bǔ)元?dú)猓簧炷闲?、石菖蒲豁痰瀉濁開竅，益母草、三七、水蛭活血逐瘀；大黃瀉熱涼血以熄風(fēng)。前期我們對(duì)復(fù)元醒腦湯治療糖尿病腦梗死的作用機(jī)制進(jìn)行了一些相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明復(fù)元醒腦湯改善糖尿病腦梗死患者神經(jīng)缺損功能,具有保護(hù)血-腦屏障的作用，通過(guò)降低血-腦屏障的通透性，減輕腦水腫；通過(guò)降低糖尿病腦梗死的胰島素抵抗程度而改善胰島素敏感指數(shù)；復(fù)元醒腦湯能顯著提升腦組織中SDF-1、CXCR4、VEGF基因及蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腦梗死缺血區(qū)域的神經(jīng)再生和微血管新生，改善缺血腦組織的血供和神經(jīng)功能的恢復(fù)[10]。復(fù)元醒腦湯的作用機(jī)制是多靶點(diǎn)的，對(duì)復(fù)元醒腦湯多種作用機(jī)制的研究有利于更加明確其作用機(jī)制。

糖尿病發(fā)腦梗死病患者，血管組織在高血糖的狀態(tài)下受到很大的損傷，患者的梗死組織中微血管稀疏，側(cè)枝化能力低，梗死組織長(zhǎng)期血供不足，神經(jīng)功能恢復(fù)差[11]，而microRNA-503對(duì)血糖有很好的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能恢復(fù)有重要作用。microRNA-503能夠通過(guò)與靶向的mRNA（CCNE1和CDC25A）互補(bǔ)配對(duì)，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)性調(diào)控，從而導(dǎo)致mRNA(CCNE1和CDC25A)降解或翻譯抑制。復(fù)元醒腦湯具有與microRNA-503抑制劑類似的治療效果。本研究解釋了復(fù)元醒腦湯在微血管內(nèi)皮細(xì)胞中對(duì)microRNA-503相關(guān)信號(hào)通路的修復(fù)機(jī)制，豐富和發(fā)展了復(fù)元醒腦湯治療腦梗死的作用機(jī)制，為探索相關(guān)治療策略提出了一條新的路徑。

4 參考文獻(xiàn)

[1]KERNAN W N,VISCOLI C M，INZUCCHI S,et al.Pioglitazone improves insulin sensitivity among nondiabetic patients with a recent transient ischemic attack or ischemic stroke[J].Stroke，2003，34(6)：1431-1436．

[2]陳淼，王宏，方邦江.復(fù)元醒腦湯治療糖尿病合并腦梗死的機(jī)制研究[J].中國(guó)急救醫(yī)學(xué)，2013，33（7）：654-657．

[3]方邦江，周爽，沈俊逸，等.復(fù)元醒腦湯對(duì)糖尿病腦梗塞大鼠胰島素抵抗干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，7（3）：374-377．

[4]梁廣雄．糖尿病合并腦梗塞的中醫(yī)臨床治療探討[J]．中外健康文摘，2008，5(7)：159.

[5]Okuno S,Saito A,Hayashi T，et al.The c-Jun N-terminal protein kinase signaling pathway mediates Bax activation and subsequent neuronal apoptosis through interaction with Bim after transient focal cerebral ischemia[J].J Neurosci,2004,24(36)：7879-7887.[6]Wang ZQ,Wu DC,Huang FB,et al.Inhibition of MEK/ERK1/2 pathway reduces pro-inflammatory cytokine interleukin-1 expression in focal cerebral ischemia[J].Brain Res,2004,996(1)：55-66.

[7]Gu Z,Qian J,Zhang G.Extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation in hippocampus after cerebralischemiamaynotinterferewithpostischemic cell death[J].Brain Res,2001,901(1)：79-84.

[8]楊翼萍，劉懷軍.絲裂原活化蛋白激酶在腦缺血損傷中的作用及其調(diào)控機(jī)制[J].中國(guó)臨床康復(fù),2006,10(10)：138-42.

[9]Choi J S,Park HJ,KimHY,et al.Phosphorylation of PTEN and Akt in astrocytes of the rat hippocampus following transient forebrain ischemia[J].Cell Tissue Res,2005,319(3)：359-366.

[10]方邦江，周爽，沈俊逸，等.復(fù)元醒腦湯對(duì)糖尿病腦梗死大鼠腦組織血流量及含水量影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].老年醫(yī)學(xué)與保健，2012，18（6）：381-385．

[11]夏燕軍.自擬祛瘀湯為主治療腦梗死84例臨床觀察[J].浙江中醫(yī)雜志,2009,44(8)：590.