云南云河藥業(yè)股份有限公司，云南 個舊 661000

白云參為桔?？平疱X豹屬植物大花金錢豹(CampanumoeajavanicaBl. subsp．Javanica) ，又名土黨參，主產(chǎn)于云南西部、西南部。本品性甘，平，補中益氣、潤肺生津。主治病后體虛、肺結(jié)核、多汗、虛咳、神經(jīng)衰弱、食欲不振、久瀉、產(chǎn)后乳汁不下[1-3]。該藥材是云南省彝藥、苗藥常用地方中草藥之一。多糖是白云參有效成分之一，具有抗衰老、抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能等作用[4-6]，具有較好研究應(yīng)用價值。但是，目前白云參多糖的測定方法研究較少。多糖的測定方法主要有硫酸蒽酮法、硫酸苯酚法、3，5-二硝基水楊酸法等等[7-10]。筆者采用硫酸-蒽酮法測定白云參多糖，以便為白云參質(zhì)量標準的提高和藥材中多糖的深入研究和綜合利用提供一定依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-2401PC紫外分光光度計(SHIMADZU)；DZF-6030A型真空干燥箱(上海恒科學儀器有限公司)；MJ-600超聲波發(fā)生器(無錫市美極超聲設(shè)備有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏儀市予華儀器有限責任公司)；FA1604電子天平(上海天平儀器廠)。

1.2 試劑和樣品 蒽酮(批號：20170420，國藥集團化學試劑有限公司)；濃硫酸(批號：20160501，重慶川東化工(集團)有限公司)；D(+)葡萄糖(批號：B21882，上海源葉生物科技有限公司)；白云參(鴻翔中藥科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 葡萄糖標準溶液制備 稱取105 ℃干燥至恒重的D(+)葡萄糖10.00 mg，用蒸餾水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，混合搖勻，即葡萄糖標準溶液濃度為0.1 mg/mL。

2.2 硫酸-蒽酮溶液(2 g/L)的配制 稱取蒽酮0.5 g，用濃硫酸溶解并定容于250 ml容量瓶中，混合均勻。

2.3 樣品溶液制備

2.3.1 白云參多糖提取與精制 準確稱取干燥的白云參粉末400 g，加80%乙醇3100 mL，超聲波提取2次，每次1 h，過濾。藥渣中加入3000 mL純化水，超聲波提取2次，每次1 h，合并提取液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.15 g/mL的清膏，加乙醇使含醇量為85%，冷藏48 h，過濾，沉淀用純化水溶解，加0.6%活性炭攪拌30 min，過濾，濾液加乙醇使含醇量為85%，冷藏36 h，過濾，沉淀在60 ℃條件下真空干燥，即得到白云參粗多糖。

2.3.2 白云參多糖溶液的配制 稱取10.10 mg白云參粗多糖，加蒸餾水溶解定容至250 mL。

2.4 測定波長 分別精密量取葡萄糖標準使用液、樣品溶液各2.0 mL，加8.0 mL硫酸-蒽酮液，在沸水浴中加熱15 min，用紫外-可見分光光度計于200～700 nm 波長范圍內(nèi)掃描。對照品和供試樣品溶液顯色后均在589 nm 處有最大吸收。因此，實驗時將589 nm 確定為測定波長。

2.5 硫酸-蒽酮溶液用量試驗 分別吸取供試樣品溶液 2.0 mL于試管中，分別加入硫酸-蒽酮溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL，搖勻，在沸水浴中加熱15 min，用自來水冷卻至室溫，加濃硫酸稀釋至14.0 mL，在589 nm處測其吸光度。由圖1 可知，隨著硫酸-蒽酮溶液量增加，相應(yīng)的吸光度值也隨之增加，當加入量達到8.0 mL 以后，溶液吸光度變化趨勢變緩。因此，實驗時顯色劑硫酸-蒽酮溶液用量選擇8.0 mL 。

2.6 加熱時間的確定 分別吸取供試樣品溶液 2.0 mL 于比色管中，按2.5確定的量加入硫酸-蒽酮溶液，搖勻，在沸水浴中加熱10、15、 20、25、30、35 min，用自來水冷卻至室溫，在589 nm處測其吸光度。由圖2可知，隨著加熱顯色時間的增加，白云參多糖溶液吸光度值先增加后減小，在加熱時間為15 min時，溶液的吸光度值最大。因此，將實驗加熱顯色時間確定為15 min 。

2.7 標準曲線的繪制 精密吸取葡萄糖標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL ，分別加蒸餾水至2.0 mL，搖勻。加8.0 mL硫酸-蒽酮液，在沸水浴中加熱顯色15 min；以 2.0 mL 蒸餾水代替葡萄糖標準溶液，顯色后作為空白。分別在589nm處測其吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度(C)為橫坐標，相應(yīng)的吸光度(A)為縱坐標，繪制吸光度-葡萄糖質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線圖，回歸方程式為Y=9.8159X+0.037，r=0.9999。實驗結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在0.0201～0.1005 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標準曲線如圖 3 所示。

2.8 方法學考察

2.8.1 精密度試驗 分別吸取6份供試樣品溶液 2.0 mL，按照標準曲線制備方法測定吸光度。結(jié)果，吸光度的平均值是0.257，RSD= 1.21%。實驗結(jié)果表明該方法的精密度良好。

2.8.2 穩(wěn)定性試驗 精密量取白云參多糖溶液 2.0 mL，按照標準曲線制備方法測定吸光度，在60 min內(nèi)每間隔10 min測定吸光度，RSD=1.26%。結(jié)果表明試樣溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.8.3 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批次白云參粗多糖10.00mg，共6份，按照所確定條件進行平行實驗，在589nm處測定吸光度，計算白云參多糖的含量。實驗結(jié)果顯示，多糖的平均含量是578mg/g，RSD=1.16%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8.4 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的白云參多糖(含量：578 mg/g)6份，每份約5 mg，分別加入葡萄糖標準品溶液30 mL于100 mL容量瓶，按照標準曲線制備方法處理，在589 nm處測定吸光度，計算回收率。結(jié)果測得的平均回收率為99.85%，RSD=0.46 %，表明實驗方法的系統(tǒng)誤差較小，準確度較高。見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

3 討論

3.1 顯色方法選擇 硫酸蒽酮法與硫酸苯酚法測多糖原理基本相似，均是多糖在強酸性條件下水解生成單糖，繼續(xù)脫水成糠醛或者糠醛類衍生物，與相應(yīng)的顯色劑顯色。硫酸苯酚法進行穩(wěn)定試驗時，數(shù)據(jù)變化較大，穩(wěn)定性稍差；另外苯酚在空氣中極易氧化成淡黃色物質(zhì)，在測定過程中需要避光和迅速操作。因此，本實驗選用硫酸蒽酮法作為白云參多糖測定方法。

3.2 對照品選擇 在進行測定對照品選擇時，分別選用葡萄糖、葡聚糖與硫酸蒽酮溶液顯色后，進行全波長范圍掃描，兩種樣品均在589 nm 處有最大吸收。但是，葡聚糖有多種分子量類型產(chǎn)品，其與硫酸蒽酮溶液顯色是否存在差異還需要進一步驗證。因此，本實驗選用葡萄糖作為對照品。

多糖類成分在藥用植物中分布廣泛，具有多種活性，白云參中含有大量的多糖類成分，但是有關(guān)白云參多糖含量測定方法的報道極少。所以，本研究以葡萄糖為對照品，硫酸蒽酮溶液為顯色劑，用紫外分光光度法測定白云參多糖含量，并進行方法學考察。實驗結(jié)果表明，該方法操作簡單，結(jié)果準確，且重現(xiàn)性好，可在一般實驗條件下進行白云參多糖含量測定，符合常規(guī)實驗要求，為白云參多糖類化合物開發(fā)利用提供一定的科學依據(jù)。