許向陽，陳小玉，趙婷婷，楊歡歡，張 賀，李景富

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030）

番茄是重要的蔬菜作物之一，產(chǎn)量高且營養(yǎng)豐富。干旱導(dǎo)致植物光合電子還原鏈過度還原，其線粒體及葉綠體內(nèi)產(chǎn)生過量活性氧，損壞植物細(xì)胞膜系統(tǒng)[1]，影響番茄正常生長發(fā)育，產(chǎn)量和品質(zhì)下降。番茄品種對干旱表現(xiàn)敏感，特別是發(fā)芽、幼苗階段。采取一定措施減輕干旱對幼苗傷害，提高幼苗抗旱性，對番茄栽培、生產(chǎn)具有重要意義。

近年來，選用類似脫落酸（ABA）等外源化學(xué)物質(zhì)處理植物以提高其抗逆性（干旱、低溫、高鹽）研究取得重大進(jìn)展[2]。ABA廣泛分布于高等植物體內(nèi)，不僅調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育且的干旱等非生物逆境也有一定調(diào)節(jié)作用。當(dāng)植物遭受逆境脅迫時，ABA在植物體內(nèi)含量不斷累積[3]，可緩解干旱等逆境對植物傷害，定向增強(qiáng)作物的環(huán)境適應(yīng)能力，提高作物抗逆性[4]，ABA也被稱為植物“脅迫激素”。近年，ABA抗旱作用備受關(guān)注。植物在缺水環(huán)境下，葉片ABA含量增加，促使保衛(wèi)細(xì)胞K+外滲，促進(jìn)孔隙封閉，減少蒸騰和水分流失，使葉片細(xì)胞保持一定水分條件，提高植物干旱耐受性[5]。在甘蔗[6]、棉花[7]、大豆[8]、小麥[9]、玉米[10-11]等主要農(nóng)作物研究中發(fā)現(xiàn)，ABA可不同程度減輕干旱對作物的影響。李長寧等和姚滿生等發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下ABA處理可降低甘蔗幼苗和棉花幼苗細(xì)胞膜上結(jié)構(gòu)骨架磷脂分子氧化，增強(qiáng)抗氧化酶活性，減少過氧化物產(chǎn)生，一定程度上保護(hù)細(xì)胞膜，提高甘蔗及棉花幼苗抗旱性[6-7]。

目前，關(guān)于ABA減緩番茄幼苗干旱脅迫，提高抗旱性研究尚無報道。ABA亦稱S-抗誘素，是啟動植物體內(nèi)抗逆基因表達(dá)的信號分子，可誘導(dǎo)某些抗逆基因表達(dá)[12-13]。本研究對4葉期番茄幼苗作適量ABA噴施和干旱處理，分析其生理生化指標(biāo)變化，通過cDNA-AFLP技術(shù)篩選ABA誘導(dǎo)后干旱脅迫下番茄幼苗差異表達(dá)基因表達(dá)模式上調(diào)的抗旱相關(guān)候選基因片段，利用實時熒光定量PCR技術(shù)驗證基因表達(dá)量模式，為外源噴施ABA提高番茄幼苗抗旱性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與處理

試驗材料為番茄栽培品種Moneymaker，試驗于2017年8～11月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站連棟溫室內(nèi)完成。采用苗盤育苗，兩葉時分苗于10 cm×10 cm營養(yǎng)缽中，常規(guī)培養(yǎng)。苗長至四葉一心時，每天早上8點噴施處理葉片。設(shè)置4組處理，處理1：清水+干旱處理（CK）；處理2：清水（CK1）；處理3：300μL·L-1ABA處理（CK2）；處理4：300μL·L-1ABA+干旱處理（A），20株為1個處理組。連續(xù)4 d對葉片藥物噴施處理，噴施時以葉片表面附著1層液珠為準(zhǔn)，處理期間以見干見濕為原則對幼苗澆水，第4天噴施后營養(yǎng)缽澆透水，進(jìn)入干旱處理不再澆水，記當(dāng)天為0 d。

于1、3、5、7 d分別對CK和A處理葉片取樣，測定生理指標(biāo)；同時分別在0、12、24、36、48、72 h時對CK、CK1、CK2、A所有處理組取適量葉片，液氮速凍存放在-80℃冰箱中，提取RNA用于cDNA-AFLP分析及實時熒光定量PCR驗證。作3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 測定項目及方法

參照李合生常規(guī)飽和、烘干稱量方法測定葉片相對含水量，抽氣法測定葉片相對電導(dǎo)率[14]。以氮藍(lán)四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶（SOD），過氧化氫酶還原法測定過氧化氫酶（CAT），愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，硫代巴比脫酸法測定丙二醛（MDA）含量[14]，結(jié)合高俊鳳[15]方法稍加改動。

Trizol法從葉片中快速提取總RNA。由Ndrop 2000微量分光光度計測定260 nm吸收值計量總RNA濃度，以260 nm/230 nm及260 nm/280 nm吸收值比值衡量其純度。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色分析RNA完整性。選用TaKaRa（大連生物工程公司）cDNA Synthesis kit（Clontech）雙鏈試劑盒合成雙鏈cDNA。按試劑說明書步驟操作，采用紫外分光光度法測定雙鏈cDNA濃度。

選取Eco RⅠ和MseⅠ兩種內(nèi)切酶酶切雙鏈cDNA，待產(chǎn)物與接頭（見表1）連接后用于預(yù)擴(kuò)增。以BLAST對提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中差異目的基因片段序列比對基因相似性，推測與之相關(guān)功能。采用熒光染料嵌合法，對內(nèi)參基因（番茄a(bǔ)ctin基因）和目的基因片段作實時熒光定量PCR（iQ5 Real Time PCRDetection System），目的基因相對表達(dá)量分析采用 2-ΔΔCt法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Microsoft Excel 2013和SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)差異顯著性。

表1 cDNA-AFLP接頭和引物序列信息Table 1 cDNA-AFLPadapter and primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下外源ABA對番茄幼苗葉片相對電導(dǎo)率和相對含水量的影響

圖1 干旱脅迫下ABA對番茄幼苗葉片相對電導(dǎo)率與相對含水量的影響Fig.1 Influence of ABA on relativeelectrical conductivity and relativewater content of tomato seedling leaves under drought stress

如圖1可知，干旱第1天，CK相對電導(dǎo)率明顯高于A處理，后期A處理和CK均呈上升趨勢，但A處理相對電導(dǎo)率始終小于CK，且差異顯著。相反，干旱初期，CK相對含水量稍高于A處理，經(jīng)干旱處理后，CK葉片含水量直線下降，第5天后，下降趨勢更加顯著，A處理前3 d雖略有下降但趨勢平緩，3 d后才明顯下降，但相對含水量始終高于CK，差異顯著。

2.2 干旱脅迫下外源ABA對番茄幼苗抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

由圖2可知，干旱第1天，CK和A處理SOD、CAT、POD活性值差異較小，隨干旱時間延長，3種抗氧化酶活性值均呈明顯上升趨勢，但SOD活性值第3天達(dá)峰值后下降，第5天又稍有上升，CAT活性值第5天達(dá)峰值后下降，而POD活性值始終呈上升趨勢。A處理抗氧化酶活性較CK上升更明顯，干旱后期活性值較初期差異顯著。相反，丙二醛含量CK始終高于A處理，干旱前3 d，CK和A處理丙二醛含量變化小，3 d后，CK丙二醛含量顯著上升，A處理稍有升高，CK與A處理差異顯著。

圖2 ABA對番茄幼苗干旱脅迫下抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響Fig.2 Influence of ABA on antioxidant activitiesand MDA content of tomato seedlings under drought stress

2.3 干旱脅迫下外源ABA對番茄幼苗基因表達(dá)的影響

2.3.1 差異表達(dá)TDFs分離

利用64對引物組合對CK2和A3處理葉片cDNA選擇性擴(kuò)增，共篩選得到112條差異表達(dá)TDF（見圖3）。根據(jù)條帶有無和擴(kuò)增條帶強(qiáng)弱，TDF表達(dá)模式可歸為以下幾類：①干旱誘導(dǎo)或增強(qiáng)表達(dá)，這類TDF僅在干旱處理的兩組中特異表達(dá)或亮度增加；②ABA誘導(dǎo)型基因，部分TDF僅在ABA處理組中特異表達(dá)或亮度增加；③ABA抑制基因，此類TDF僅在非ABA處理組中表達(dá)；④干旱和ABA同時誘導(dǎo)或ABA加強(qiáng)誘導(dǎo)，TDF僅在ABA+干旱處理組中表達(dá)或亮度增加；⑤ABA+干旱抑制表達(dá)，少數(shù)TDF僅ABA+干旱下不表達(dá)；⑥干旱或ABA抑制表達(dá)，僅在無任何處理CK1中表達(dá)；⑦干旱抑制表達(dá)，在非干旱處理下表達(dá)。本試驗中，干旱下ABA加強(qiáng)基因表達(dá)均屬于本研究需獲得基因類型。

圖3 部分cDNA-AFLP特異性引物篩選結(jié)果Fig.3 Result of somescreen special cDNA-AFLPprimers

2.3.2 序列比對和功能分析

為了解干旱脅迫下外源ABA對番茄幼苗分子調(diào)控機(jī)理，在已有112條差異表達(dá)基因片段中挑選87條，二次PCR擴(kuò)增、回收、克隆并測序，最終得到51個有效序列。

對51個有效序列作BLAST比對，序列結(jié)果表明22個有效序列與已知功能基因具有高度同源性，18個與未知功能基因及假定基因具有高度同源性，重復(fù)序列11個。22個同源基因生物學(xué)功能主要包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、逆境響應(yīng)、細(xì)胞代謝與代謝途徑相關(guān)酶基因。如片段TDF33與番茄轉(zhuǎn)錄因子CBF1同源性值為94%，差異片段TDF71又與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相似，其比對E值為0.083，參與響應(yīng)逆境脅迫（見表2）。

表2 部分差異表達(dá)片段序列同源性比對結(jié)果Table 2 Homology comparison results of partial differentially expressed fragment(TDF)sequences

2.3.3 四個抗旱相關(guān)基因差異表達(dá)模式熒光定量PCR分析

為驗證cDNA-AFLP結(jié)果準(zhǔn)確性并進(jìn)一步探究番茄抗旱差異表達(dá)基因片段在不同干旱時間點表達(dá)情況，選取4個干旱脅迫下受ABA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因片段（TDF23、TDF56、TDF62、TDF72）作熒光定量PCR分析。

圖4 干旱脅迫下ABA預(yù)處理番茄幼苗及對照抗旱相關(guān)基因相對表達(dá)Fig.4 Relative expression of drought-resistant genes in tomato seedlings pretreated with ABA and control under drought stress

由圖4可知，4種不同抗旱相關(guān)基因隨干旱時間增加，基因表達(dá)量均較初期明顯增加，基本呈先升后降趨勢。但表達(dá)量上升到最大值時間點不同，TDF23在24 h，而TDF56、TDF62、TDF72在36 h。其次，四個不同基因相同時間點基因表達(dá)量為A處理高于CK，僅有TDF23和TDF72在12 h時CK表達(dá)量稍高于A處理。

3 討論

植物經(jīng)干旱處理后，植株抗旱性越強(qiáng)，葉片抗脫水能力越強(qiáng)，葉片RWC含量越高[16]。干旱脅迫時，RWC含量降低，破壞自由基平衡代謝，產(chǎn)生大量自由基，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，得到具有毒性的氧化終產(chǎn)物MDA，加劇膜系統(tǒng)損傷[17]；質(zhì)膜滲透性增加，電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨干旱脅迫時間延長，葉片RWC含量顯著降低，而MDA含量明顯增加，相對電導(dǎo)率顯著上升，與陳青奇等研究結(jié)果一致[18-19]。此外，番茄幼苗葉片在噴施ABA預(yù)處理后，相對電導(dǎo)率始終低于對照，與尹松松等研究結(jié)果一致[20]，相對水含量下降趨勢也較對照相對平緩。一定程度上說明外源ABA預(yù)處理可減輕膜系統(tǒng)在干旱脅迫下的損傷。

SOD是生物體內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化酶，亦稱自由基清除劑，其活性可作為判斷植物抗逆性指標(biāo)，可催化有毒超氧自由基反應(yīng)生成無毒O2和H2O2，存在于植物體葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中CAT和過氧化物酶體中POD可進(jìn)一步清除有毒害作用H2O2，生成無害O2，減少自由基對膜的傷害。因此，SOD、CAT、POD活性可衡量植物抗旱能力[21]。本試驗中，ABA預(yù)處理后，不同程度增加抗氧化酶活性，與郭貴華等[22]和趙宏偉等[19]研究一致，但郭貴華等研究中，3種酶在干旱及ABA處理后始終呈上升趨勢。本試驗中，后期SOD和CAT酶活性有所下降，可能是不同作物不同生長期導(dǎo)致的差異。

植物抗逆性均是多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀[23]，許多基因在逆境環(huán)境下不同程度表達(dá)，其產(chǎn)物蛋白或RNA作用于植物細(xì)胞，響應(yīng)干旱等非生物逆境以提高其抗逆性[24]。本研究中，干旱脅迫下部分TDF差異性表達(dá)，說明干旱脅迫不同程度影響基因表達(dá)，差異表達(dá)片段調(diào)控植物抗旱性。為明確植物抗旱性分子調(diào)控機(jī)制，學(xué)者鑒定和分析大量干旱脅迫誘導(dǎo)基因，在模式植物如水稻和擬南芥上研究更深入，已鑒定數(shù)百個抗旱相關(guān)誘導(dǎo)基因[25]。本研究中有22個cDNAs對應(yīng)的TDF與已鑒定的干旱脅迫相關(guān)功能基因具有高度同源性，某種程度上表明不同植物對干旱脅迫耐受性具有相似分子基礎(chǔ)。

ABA是啟動植物體內(nèi)抗逆基因表達(dá)“第一信使”，可誘導(dǎo)某些抗逆基因表達(dá)，調(diào)控抗逆代謝反應(yīng)。在干旱、低溫、高鹽等逆境中有重要作用且受ABA誘導(dǎo)的基因已被相繼克隆，如番茄SINAC41、玉米MAPK等[26-27]。本試驗中，四種抗旱相關(guān)TDF在干旱脅迫期間，基因表達(dá)量均高于初期，說明其對干旱脅迫產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)。盡管4種片段基因表達(dá)量均先升后降，但初始CK和A處理中TDF23、TDF56和TDF72表達(dá)水平相似，后期差異性較為明顯，可能因TDF在后期受ABA誘導(dǎo)更為明顯。TDF62的CK和A處理基因表達(dá)量趨勢相同，但表達(dá)量A處理始終高于CK，可能是TDF62片段基因較其他3個TDF受干旱影響更強(qiáng)烈，而ABA對其表達(dá)起促進(jìn)作用。因此推測ABA預(yù)處理番茄幼苗對干旱高抗性與抗旱相關(guān)基因較高表達(dá)緊密相關(guān)。為更全面揭示ABA誘導(dǎo)基因表達(dá)與逆境脅迫之間聯(lián)系，其機(jī)理尚需深入研究。

4 結(jié) 論

ABA預(yù)處理可有效緩解干旱脅迫對番茄幼苗生理生化及代謝功能損傷，一定程度減輕干旱對幼苗影響。結(jié)合cDNA-AFLP及實時熒光定量驗證經(jīng)ABA預(yù)處理的番茄幼苗可促進(jìn)抗旱基因相關(guān)表達(dá)并提高其抗旱性。