鄧念華 沈富兵 鄭崛村 沈岱 王玲

中圖分類號 R575；Q23 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）23-3203-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.08

摘 要 目的：探討α-苦瓜素誘導肝細胞L02（簡稱“L02細胞”）早期凋亡的信號通路。方法：制備并純化α-苦瓜素。采用流式細胞術檢測0（陰性對照）、160、80 μg/mL α-苦瓜素作用L02細胞2～8 h后的細胞凋亡率。小干擾RNA（siRNA）沉默低密度脂蛋白受體相關蛋白1（LRP1）得到LRP1-siRNA細胞，然后采用液相芯片分析術檢測α-苦瓜素（160 μg/mL）分別作用L02細胞（正常組）和LRP1-siRNA細胞（沉默組）0、0.25、0.5、1、2 h后c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路中促調蛋白磷酸化JNK（p-JNK）、磷酸化凋亡前體蛋白（p-Bad）、胱天蛋白酶9（Caspase-9）及抑調蛋白磷酸化蛋白53（p-p53）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、磷酸化B淋巴細胞瘤2（p-Bcl-2）、Caspase-8的表達情況，分析α-苦瓜素對L02細胞JNK信號通路的作用。結果：制備并純化得到α-苦瓜素（純度>97%）；與陰性對照組比較，160 μg/mL α-苦瓜素作用8 h時，可顯著誘導細胞早期凋亡（P<0.05），80 μg/mL α-苦瓜素誘導的早期凋亡不明顯（P>0.05）；與0 h比較，作用后0.25 h促調蛋白p-JNK、p-Bad和Caspase-9表達量顯著增加（P<0.05），而抑調蛋白p-p53、p-Akt、p-Bcl-2和Caspase-8表達量無變化；與正常組相比，沉默組各時間點的p-JNK、p-Bad和Caspase-9的表達均顯著減少（P<0.05）。結論：α-苦瓜素可能通過LRP1受體介導JNK信號通路誘導肝細胞凋亡，為揭示其肝毒性提供了參考。

關鍵詞 α-苦瓜素；凋亡；肝細胞L02；c-Jun氨基末端激酶信號通路；低密度脂蛋白受體相關蛋白1

ABSTRACT OBJECTIVE： To explore the signaling pathway of α-momordicin inducing early apoptosis of hepatocyte L02 （called “the L02 cell” for short）. METHODS： α-momordicin was prepared and purified. Flow cytometry was used to detect the apoptotic rate of the L02 cell after treated with 0 （negative control）， 160 and 80 μg/mL of α-momordicin for 2-8 h. LRP1-siRNA cells were obtained by small interfering RNA （siRNA） silencing low density lipoprotein receptor-related protein 1 （LRP1）. The expression of proapoptotic protein p-JNK， p-Bad， Caspase-9， inhibitor of apoptosis protein p-p53， p-Akt，p-Bcl-2 and active Caspase-8 in the L02 cell （normal group） and LRP1-siRNA （silence group） after treated with α-momordicin for 0， 0.25， 0.5， 1， 2 h were determined by liquid biochip analysis in c-Jun N-terminal kinase （JNK） signaling pathway. Effects of α-momordicin on JNK signaling pathway were analyzed. RESULTS： α-momordicin could be prepared and purified （purity>97%）. Compared with negative control group， 160 μg/mL α-momordicin could significantly induced early apoptosis of the cell after treated for 8 h （P<0.05）； early apoptosis of the cell induced by 80 μg/mL α-momordicin was not obvious （P>0.05）. Compared with 0 h， the expression of p-JNK， p-Bad and Caspase-9 were increased significantly and even reached the peak value 0.25 h after medication （P<0.05）， while the expression of p-p53， p-Akt， p-Bcl-2 and Caspase-8 had no change. Compared with normal group， the expression of p-JNK， p-Bad and Caspase-9 of silence group were decreased significantly at different time points （P<0.05）. CONCLUSIONS： α-momordicin can induce the apoptosis of hepatocytes via LRP1 receptor mediated JNK signaling pathway， and will provide the reference for its hepatotoxicity.

KEYWORDS α-momordicin； Apoptosis； Hepatocyte L02； c-Jun N-terminal kinase signaling pathway； Low density lipoprotein receptor-related protein 1

α-苦瓜素是從苦瓜種子中提取的Ⅰ型核糖體失活蛋白（Ribosome-inactivating proteins，RIPs），具有抗腫瘤、抗病毒等多種藥理學作用[1-2]。據(jù)相關研究報道，α-苦瓜素通過激活凋亡信號通路胱天蛋白酶3（Caspase-3），誘導乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞凋亡[3]。本課題組在前期試驗中發(fā)現(xiàn)，α-苦瓜素雖能顯著抑制MCF-7細胞移植瘤的增殖，但也能引起動物肝功能的異常和肝細胞的壞死[4-5]，使得其臨床應用受到阻礙。

目前有研究發(fā)現(xiàn)，同為Ⅰ型RIPs的天花粉蛋白（TCS）能通過低密度脂蛋白受體相關蛋白1 （LRP 1）受體介導進入腫瘤細胞[6-7]。LRP1既是一種內吞型受體，同時也具有信號轉導的功能，能激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）/促絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號轉導途徑調節(jié)細胞增殖和凋亡[8]。由于LRP1在肝細胞上分布極為豐富[9]，故筆者推測，α-苦瓜素可能通過該信號轉導通路誘導肝細胞凋亡。

本研究以正常人胚肝細胞L02（簡稱“L02細胞”）為試驗對象，以流式細胞術分析α-苦瓜素誘導的肝細胞凋亡，以液相芯片分析技術檢測α-苦瓜素作用后，JNK信號通路凋亡信號蛋白中促調蛋白JNK、凋亡前體蛋白（Bad）、Caspase-9和抑調蛋白蛋白53（p53）、蛋白激酶B（Akt）、B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）、Caspase-8的表達水平變化，并以LRP1基因敲降法[10]驗證該信號通路的LRP1 受體介導作用，從而闡明α-苦瓜素誘導細胞凋亡的發(fā)生途徑，為揭示α-苦瓜素誘導的肝臟毒性發(fā)生機制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BX51倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Accuri 6流式細胞儀（美國BD公司）； 76S/02324凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；Luminex 200液相芯片檢測分析系統(tǒng)（美國Millipore公司）；AKTA蛋白質純化系統(tǒng)（美國GE公司）；UltrafleⅩⅢ飛行時間質譜儀、MaXis電噴霧四級桿飛行時間質譜儀（美國Bruker 公司）。

1.2 藥品與試劑

苦瓜種子（四川省農科院種子公司，批號：20160912）；Annexin Ⅴ-FITC凋亡試劑盒（美國BioVision公司，批號：K201-100）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號：C11875500BT）；胎牛血清（美國HyClone公司，批號：NUCO53）；兔抗人LRP1抗體（美國Abcam公司，批號：AB7975）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（美國R&D公司，批號：HY90077）；β-肌動蛋白（β-actin）抗體（美國Novus公司）；人早凋信號蛋白檢測試劑盒（內含Akt、JNK、Bad、Bcl-2、p53磷酸化抗體和Caspase-8、Caspase-9抗體，美國Millipore公司，批號：48-669MAG）；LRP1小干擾RNA（siRNA）試劑盒[內含A、B、C 3種序列siRNA和非特異性siRNA，3種序列siRNA分別為LRP1-siRNA-A（5′ -ACACCAAUAAGAAG- CAGAUCAAUGT-3′ ）、LRP1-siRNA-B（5′ -AGAUUUGUCCACAGAGUAAGGCCCA-3′ ）、LRP1-siRNA-C（5′ - GGCUGUGACUGACGAGGAACCGUTT-3′ ）]、Trans1.0轉染試劑均購自美國Origene公司；細胞裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑均購自美國Millipore公司。

1.3 細胞

人胚肝細胞L02購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

2 方法

2.1 α-苦瓜素的制備及純化鑒定

將苦瓜種子研磨成粉末并用50 mmol/L醋酸鹽緩沖溶液（pH=6.3）萃取，得到α-苦瓜素粗提樣品；在2 ℃條件下向粗提物中加入250 mmol/L HCl增溶，1 000 r/min離心后，取上清液用1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.0）中和，再用硫酸銨沉淀蛋白，得硫酸銨沉淀蛋白樣品；再分別經SP-瓊脂糖凝膠色譜、離子交換層析、凝膠過濾色譜純化后，得到α-苦瓜素蛋白純品。分別對上述純化過程收獲的中間樣品（硫酸銨沉淀蛋白樣品、SP-瓊脂糖凝膠色譜洗脫樣品、離子交換層析樣品）以及純化后α-苦瓜素蛋白純品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），并對純化后α-苦瓜素蛋白純品進行高效液相色譜（HPLC）純度測定和飛行時間質譜分子量分析以及電噴霧四極桿質譜N-末端氨基酸序列分析。

2.2 細胞培養(yǎng)

肝細胞L02采用含有10%胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 α-苦瓜素誘導的細胞凋亡檢測

按1×105個/孔將L02細胞接種在6孔板中，待細胞貼壁達50%～60%融合度時，分別加入終質量濃度為0（陰性對照）、80、160 μg/mL的α-苦瓜素，并于給藥2、4、8 h后消化并重懸各孔細胞，加入5 μL Annexin Ⅴ和10 μL碘化丙啶（PI），用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，以FlowJo 10軟件分析凋亡細胞的分布情況。

2.4 LRP1-siRNA轉染細胞

將L02細胞接種于6孔板中，設置LRP1-siRNA-A組、LRP1-siRNA-B組、LRP1-siRNA-C組、非特異性siRNA組和陰性對照組（PBS）。當細胞生長融合度達到30～40%時，分別向各組培養(yǎng)基中加入4 μL 5 mmol/L的LRP1-siRNA（A、B、C 3種）、非特異性siRNA和PBS，然后加入20 μL Trans1.0轉染試劑。轉染4 h后，將培養(yǎng)液更換為含有雙抗體（青霉素-鏈霉素）的10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

2.5 Western blot法檢測LRP1-siRNA沉默作用

采用Western blot檢測siRNA基因的沉默效果。裂解“2.4”項各組細胞，提取蛋白，經SDS-PAGE分離、轉膜、封閉、分別加入一抗兔抗人LRP1抗體（1 ∶ 20 000），過夜冷藏，TBST緩沖液洗膜，分別加入二抗HRP-羊抗兔IgG（1 ∶ 1 000），37 ℃孵育1 h，TBST緩沖液洗膜，采用化學發(fā)光法檢測成像結果，β-actin作為內參對照，篩選出使LRP1蛋白缺失85%以上的陽性LRP1-siRNA用于后續(xù)試驗。

2.6 液相芯片法檢測α-苦瓜素對凋亡信號蛋白的影響

2.6.1 分組及給藥 （1）正常組。將對數(shù)生長期的L02細胞接種于6孔板中，融合度60%時加入終質量濃度為160 ?g/mL的α-苦瓜素，分別于作用0、0.25、0.5、1、2 h后以RIPA裂解細胞并收集細胞裂解液樣品，4 ℃下10 000 r/min離心，收集各上清液。（2）LRP1-siRNA沉默組。以“2.5”項篩選的陽性LRP1-siRNA轉染L02細胞，培養(yǎng)72 h后，同上述方法給藥處理，并收集各上清液。經BCA法測定如上所有上清樣品的蛋白含量，并調整蛋白質量濃度至0.4 mg/mL，-80 ℃保存。

2.6.2 凋亡信號蛋白的檢測 采用液相芯片分析系統(tǒng)檢測各組細胞在α-苦瓜素（160 ?g/mL）作用0～2 h后磷酸化JNK （p-JNK）、磷酸化Bad（p-Bad）、Caspase-9、磷酸化p53（p-p53）、磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化Bcl-2（p-Bcl- 2）、Caspase-8的表達水平，具體試驗操作嚴格參考人早凋信號蛋白檢測試劑盒說明書，以檢測的各組細胞目標蛋白的熒光強度（MFI值）反映其表達水平。將檢測到的各組細胞中p-JNK、p-Bad、Caspase-9、p-p53、p-Akt、p-Bcl-2、Caspase-8的MFI值作為縱坐標，α-苦瓜素作用時間為橫坐標，繪制熒光強度-時間曲線圖。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 α-苦瓜素蛋白的純化鑒定結果

純化得到α-苦瓜素蛋白純品，經HPLC色譜分析純度大于97%；飛行時間質譜分析得出α-苦瓜素蛋白樣品分子量為28 551.6 Da，電噴霧四極桿質譜分析得出該蛋白樣品N-末端5個氨基酸序列N-天冬氨酸-纈氨酸-絲氨酸-苯丙氨酸-精氨酸，經查詢，與NCBI公布的α-苦瓜素序列一致（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），表明純化得到的蛋白樣品即為α-苦瓜素蛋白。α-苦瓜素純化過程及最終蛋白純品的SDS-PAGE電泳結果見圖1。

3.2 α-苦瓜素誘導L02細胞早期凋亡結果

流式細胞儀檢測結果顯示，α-苦瓜素質量濃度為160 μg/mL時，誘導L02細胞的細胞凋亡率分別為2.8%（2 h）、3.8%（4 h）和6.2%（8 h），α-苦瓜素質量濃度為80 μg/mL時，誘導L02細胞的細胞凋亡率分別為2.6%（2 h）、3.4%（4 h）和3.8%（8 h）。與陰性對照組比較，160 μg/mL（8 h）的細胞凋亡率顯著升高（P<0.05），80 μg/mL各時段的細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。α-苦瓜素誘導L02細胞凋亡的檢測結果如圖2。

3.3 Western blot檢測LRP1-siRNA的基因沉默結果

檢測結果顯示，L02細胞的LRP1受體經siRNA法基因沉默72 h后，LRP1-siRNA-C組蛋白條帶缺失在85%以上，表現(xiàn)出了良好的沉默效果。L02細胞LRP1- siRNA沉默效果的蛋白電泳圖見圖3。

3.4 α-苦瓜素對L02細胞凋亡信號蛋白表達的影響結果

各組細胞中p-JNK、p-Bad、Caspase-9、p-p53、p-Akt、p-Bcl-2、Caspase-8熒光強度-時間曲線圖見圖4。

由圖4可知，正常組于給藥0.25 h時各促調蛋白p-JNK，p-Bad和活化Caspase-9表達達到高峰，直至給藥2 h時依然處于較高水平，且與0 h比較有顯著差異（P<0.05）；各抑調蛋白p-p53、p-Akt、p-Bcl-2、活化Caspase-8各時段表達無顯著變化。與正常組比較，LRP1-siRNA沉默組各時段促調蛋白表達明顯抑制（P<0.05），而抑凋蛋白的表達無顯著變化。表明LRP1受體的基因沉默可以顯著阻止α-苦瓜素對L02細胞的凋亡信號轉導作用。

4 討論

苦瓜入藥在《本草綱目》《滇南本草》中早有記載[11]，從苦瓜種子中提取的α-苦瓜素具有抗腫瘤、抗病毒等作用，是一種藥用價值較高的天然藥物[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，α-苦瓜素屬于RIPS，同天花粉蛋白一樣，被證實對乳腺癌、絨毛膜細胞癌、黑色素瘤等皆有較強的抗腫瘤活性，已成為腫瘤治療的候選藥物之一[12-13]。在本課題組前期抗腫瘤試驗中發(fā)現(xiàn)，α-苦瓜素雖能顯著抑制人乳腺癌MCF-7移植瘤的增殖，但同時也能引起動物食欲減退、精神萎靡、肝功能異常等[3，14]；因此闡明α-苦瓜素肝細胞損傷機制可為其藥物開發(fā)提供依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，流式細胞術檢測質量濃度為160 μg/mL的α-苦瓜素濃度作用于L02細胞8 h后可誘導L02細胞早期凋亡。α-苦瓜素作用L02細胞后，其促調蛋白p-JNK、p-Bad、Caspase-9蛋白水平顯著升高，并在給藥后0.25～2 h達到高峰，而抑調蛋白p-p53、p-Akt、p-Bcl- 2、Caspase-8蛋白處于靜止或被抑制狀態(tài)，由此證明了α-苦瓜素具有誘導L02細胞凋亡的作用。JNK信號轉導過程即當外源性刺激物與細胞膜受體結合，激活細胞內蛋白激酶導致JNK和下游Bad蛋白的磷酸化，Bad一方面可抑制Caspase-8，另一方面可活化Caspase-9，從而導致了細胞凋亡[15]。這7種凋亡蛋白是JNK信號轉導的重要通路蛋白，本試驗結果也符合JNK信號途徑傳遞的細胞凋亡信息，初步揭示了α-苦瓜素誘導肝細胞凋亡的發(fā)生機制。

進一步的試驗發(fā)現(xiàn)，當α-苦瓜素的特異性細胞受體LRP1被siRNA基因沉默后，JNK的信號途徑的相關蛋白被明顯抑制。LRP1是一種多配體共用受體，其細胞質區(qū)域具有由天冬酰胺殘基（N）、脯氨酸殘基（P）及任何氨基酸殘基（x）和酪氨酸殘基（Y）組成的兩個信號結構域（NPxY）[16-17]，這些信號結構域可以作為信號轉導位點參與下游信號傳導，能通過MAPK信號通路來調節(jié)細胞增殖和凋亡[8]，JNK途徑是MAPK通路的一種，主要發(fā)揮細胞凋亡的轉導。因此，本試驗結果也說明，α-苦瓜素的信號轉導作用是由LRP1受體的介導完成的。

本研究初步證明，通過JNK信號通路轉導的細胞凋亡是α-苦瓜素引起肝細胞毒性的早期發(fā)生機制。α-苦瓜素與LRP1結合后，被介導內吞入細胞中，抑制相關蛋白的表達，從而激發(fā)肝細胞凋亡，可為后續(xù)研究揭示α-苦瓜素的肝臟毒性發(fā)生機制提供參考。

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（收稿日期：2018-07-11 修回日期：2018-10-24）

（編輯：唐曉蓮）