杜銀飛 嵇增云 信莎莎 董玉

摘 要 目的：分析蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4的特征圖譜。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為 Agilent Extend C18，流動相為0.4%乙酸溶液-甲醇（梯度洗脫），流速為0.6 mL/min，檢測波長為286 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。分別對復(fù)方述達(dá)格-4全方及各單味藥體內(nèi)外特征圖譜進(jìn)行分析和對比。結(jié)果：復(fù)方述達(dá)格-4全方體外特征圖譜有47個峰；其體內(nèi)特征圖譜有24個峰，其中峰1、4、7～9、12、14、18～20、22、25、38～41、44、46對應(yīng)的18個成分為體外直接入血成分；各單味藥體內(nèi)特征圖譜中峰1、4、7、8、12、14、18～22、25、40、46來源于高良姜藥材；峰14、18、19、22、44來源于木香藥材；峰1、4、7～9、12、14、18、19、22來源于石菖蒲藥材。結(jié)論：直接入血成分及代謝產(chǎn)物可能為復(fù)方述達(dá)格-4在體內(nèi)發(fā)揮作用的有效成分；該方法可用于其特征圖譜的分析。

關(guān)鍵詞 蒙藥；復(fù)方述達(dá)格-4；特征圖譜；化學(xué)成分；體內(nèi)；體外

中圖分類號 R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）22-3110-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.19

ABSTRACT OBJECTIVE： To analyse characteristic chromatograms of Mongolian Compound Shudage-4. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent Extend C18 with mobile phase consisted of 0.4% acetic acid solution-methanol （gradient elution） at the flow rate of 0.6 mL/min. The detection wavelength was set at 286 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 20 μL. The in vivo and in vitro characteristic chromatograms of allsquare of Compound Shudage-4 and single ingredients were analysed and compared respectively. RESULTS： Totally 47 peaks were identified from in vitro characteristic chromatograms of allsquare of Compound Shudage-4. There were 24 common peaks from in vivo characteristic chromatograms，among which 18 ingredients corresponding to common peaks 1， 4， 7-9， 12， 14， 18-20， 22， 25， 38-41， 44， 46 were direct blood components in vitro； peaks 1， 4， 7， 8， 12， 14， 18-22， 25， 40 and 46 of serum test sample were from Alpinia officinarum； peaks 14， 18， 19， 22， 44 were from Aucklandia lappa； peaks 1， 4， 7-9， 12， 14， 18， 19， 22 were from Acorus tatarinowii. CONCLUSIONS： Blood components and some metabolites may beallsquare of Compound Shudage-4. The method can be used for the analysis of characteristic chromatograons of it.

KEYWORDS Mongolian medicine； Compound Shudage-4； Characteristic chromatogram； Chemical component； in vivo； in vitro

復(fù)方是蒙醫(yī)臨床用藥的主要形式，具有組方復(fù)雜多樣的特點(diǎn)。闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，找到適用于復(fù)雜體系的分析方法，一直是蒙藥及其復(fù)方研究的關(guān)鍵問題[1]。除腸道用藥和外用藥等少數(shù)藥物外，多數(shù)藥物的藥效物質(zhì)均以血液為遞質(zhì)運(yùn)送至作用靶點(diǎn)，產(chǎn)生相應(yīng)的藥理作用[2]。因此，通過分析含藥血清，對血中移行成分進(jìn)行檢測，以確定蒙藥復(fù)方中的直接作用物質(zhì)，是其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的有效途徑之一[3]。

復(fù)方述達(dá)格-4又名菖蒲四味，由高良姜、紫硇砂、木香、石菖蒲4味藥材按質(zhì)量比4 ∶ 2 ∶ 1 ∶ 1組合而成，臨床多用于膈肌痙攣、胸悶氣短、胸肋刺痛、消化不良等癥的治療，是蒙醫(yī)常用的消喘止痛傳統(tǒng)配方?！秶倚l(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊》[4]僅涉及復(fù)方述達(dá)格-4各味藥材的鑒別與含量測定，并未收載此復(fù)方。本課題組前期對復(fù)方述達(dá)格-4的化學(xué)成分、質(zhì)量控制、藥理作用方面進(jìn)行了大量研究[5-9]，但對其特征圖譜涉及較少。因此，本試驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）對復(fù)方述達(dá)格-4特征圖譜初步分析，為其后續(xù)藥動學(xué)研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括DEACB06007梯度泵、DEAAC21236自動進(jìn)樣器、DEAAX04861檢測器、JPAAJ82372柱溫箱、DEACN22944化學(xué)工作站（美國Agilent公司）；BT25S型十萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S型電熱恒溫水浴鍋（北京市長風(fēng)儀器儀表公司）；Vortex-GENIE型微型旋渦混合儀（美國Scientific Industries公司）；3-18K型低溫高速離心機(jī)（美國Sigma公司）；移液器（德國Eppendorf公司，規(guī)格：0.5～10、10～100、20～200 μL）；BCD-272型冰箱（博西華家用電器有限公司）。

1.2 試劑

山柰酚對照品（批號：20160328，純度：99.8%）、山柰素對照品（批號：20160812，純度：99.8%）、高良姜素-3-甲醚對照品（批號：20170919，純度：99.8%）均購自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；蘆丁對照品（批號：100080-201209，純度：99.4%）、茴香酸對照品（批號：100097-199402，純度：99.8%）、槲皮素對照品（批號：100081-200406，純度：99.8%）、丁香酚對照品（批號：110725-201414，純度：99.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院； 1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮對照品、高良姜素對照品（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)氫譜、碳譜鑒定結(jié)構(gòu)，經(jīng)HPLC法檢測以峰面積歸一化法計(jì)算純度均大于95%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

高良姜（批號：150201）、紫硇砂（批號：170701）、木香（批號：170601）、石菖蒲（批號：171001144）藥材均購自內(nèi)蒙古天立藥業(yè)有限公司，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院李驍副教授鑒定為真品。

1.4 動物

清潔級健康Wistar大鼠36只，雄性，約2月齡，體質(zhì)量250～300 g，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蒙）2015-0001；動物使用許可證號：SYXK（蒙）2015-0001]。標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，適宜溫度、濕度，人工黑暗和光照交替。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.4%乙酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：0.6 mL/min；檢測波長：286 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液和血清的制備

2.2.1 對照品溶液 分別稱取高良姜素、山柰酚、山柰素、高良姜素-3-甲醚、蘆丁、茴香酸、槲皮素、丁香酚、1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮對照品各適量，分別加甲醇溶解，制成單一對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取復(fù)方述達(dá)格-4方中高良姜、紫硇砂、木香、石菖蒲藥材（4 ∶ 2 ∶ 1 ∶ 1，m/m/m/m）共約20 kg，乙醇回流提取2次，合并提取液（回收溶劑），超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理5 min，經(jīng)大孔樹脂柱洗脫，洗脫液濃縮干燥得粉末（全方）；各單味藥按全方比例分別同法制成粉末，分別加甲醇溶解，4 ℃貯藏，備用。

2.2.3 空白血清和含藥血清 36只大鼠隨機(jī)分成空白對照組（等體積水）、復(fù)方述達(dá)格-4（全方）組（6.3 g/kg）、 高良姜組（6.3 g/kg）、紫硇砂組（6.3 g/kg）、木香組（6.3 g/kg）、石菖蒲組（6.3 g/kg）[8]，每組6只。各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，空白對照組大鼠灌胃等體積水1次。大鼠給藥120 min后，乙醚吸入麻醉，腹主動脈采血適量，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，即得空白血清和各含藥血清，置于-20 ℃冰箱中貯藏，備用。

2.2.4 供試血清 分別取“2.2.3”項(xiàng)下空白血清和各含藥血清0.5 mL，分別置于10 mL離心管中，加入2 mL乙腈，渦旋1 min，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，氮?dú)獯蹈桑芗尤?.15 mL水使沉淀充分溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下單一對照品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，理論板數(shù)以高良姜素、山柰酚、山柰素、高良姜素-3-甲醚、蘆丁、茴香酸、槲皮素、丁香酚、1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮峰計(jì)均不低于3 000；基線分離良好，分離度均大于1.5。

2.4 復(fù)方述達(dá)格-4全方及各單味藥體外特征圖譜分析

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，復(fù)方述達(dá)格-4全方體外特征圖譜顯示有47個峰，其中，峰1～8、12、15～18、20、23～30、35、38～43、46來源于高良姜藥材；峰2～4、6～11、13、15、16、18、19、22、24來源于木香藥材；峰1～3、5、11～16、18、19、23、24、28、29、32、33、36、39、41～44來源于石菖蒲藥材。經(jīng)與對照品色譜圖比對，確定峰10對應(yīng)成分為蘆丁，峰11對應(yīng)成分為茴香酸，峰20對應(yīng)成分為槲皮素，峰22對應(yīng)成分為丁香酚，峰24對應(yīng)成分為山柰酚，峰29對應(yīng)成分為1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羥基）苯基-5-醇-3-庚酮，峰38對應(yīng)成分為高良姜素，峰39對應(yīng)成分為山柰素，峰40對應(yīng)成分為高良姜素-3-甲醚。

2.5 復(fù)方述達(dá)格-4全方體內(nèi)特征圖譜分析

取“2.2.4”項(xiàng)下復(fù)方述達(dá)格-4全方供試血清和空白供試血清各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖2。由圖2可知，復(fù)方述達(dá)格-4全方體內(nèi)特征圖譜與圖1A比對，峰1、4、7～9、12、14、18～20、22、25、38～41、44、46對應(yīng)的18個成分為共同存在的成分（即體外直接入血成分），其他成分在圖1A中未找到對應(yīng)峰，推測為代謝產(chǎn)物；峰14、19、20、22、44對應(yīng)的成分在血中相對含量增高（峰面積增大），而峰38～41對應(yīng)的成分入血后其相對含量降低（峰面積減?。?。

2.6 復(fù)方述達(dá)格-4各單味藥體內(nèi)特征圖譜分析

取“2.2.4”項(xiàng)下各單味藥供試血清和空白供試血清各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖3。經(jīng)圖3與圖2A對比可知，峰1、4、7、8、12、14、18～22、25、40、46來源于高良姜藥材；峰14、18、19、22、44來源于木香藥材；峰1、4、7～9、12、14、18、19、22來源于石菖蒲藥材。經(jīng)與對照品色譜圖比對，確定峰20對應(yīng)成分為槲皮素，峰22對應(yīng)成分為丁香酚，峰24對應(yīng)成分為山柰酚，峰38對應(yīng)成分為高良姜素，峰39對應(yīng)成分為山柰素，峰40對應(yīng)成分為高良姜素-3-甲醚。

3 討論

一般認(rèn)為，生物樣品中內(nèi)源性雜質(zhì)較多，所含成分復(fù)雜，且相關(guān)成分含量較低，為了凸顯待測成分、保護(hù)色譜柱，需對生物樣品進(jìn)行前處理。常用的處理方法包括有機(jī)溶劑沉淀蛋白法、強(qiáng)酸沉淀蛋白法、重金屬鹽沉淀蛋白法、液液萃取法等[10]。預(yù)試驗(yàn)中，筆者分別考察了以乙腈或甲醇或L-抗壞血酸+乙酸乙酯處理血清的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈處理血清樣品后可得較全的色譜峰，因此確定以乙腈與血清按體積比4 ∶ 1進(jìn)行處理，去除蛋白質(zhì)。

預(yù)試驗(yàn)中，筆者采用腹主動脈采血，分別考察了大鼠灌胃給藥30、60、90、120、150、180 min后血清樣品的HPLC圖。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，大鼠灌胃給藥120 min后血清樣品的HPLC圖色譜峰數(shù)目較多，因此確定120 min為最終采血時間點(diǎn)。

經(jīng)復(fù)方述達(dá)格-4全方體內(nèi)外特征圖譜比對，發(fā)現(xiàn)有24個血中移行成分，其中有18個成分為體外直接入血成分，另外6個成分推測為代謝產(chǎn)物。其中，高良姜素、山柰素與高良姜素-3-甲醚在體外特征圖譜中相對峰面積較大，但三者在體內(nèi)特征圖譜中相對峰面積明顯減小。經(jīng)分析，可能是由于高良姜素、山柰素與高良姜素-3-甲醚在體內(nèi)未被充分游離或者是代謝為其他產(chǎn)物。本試驗(yàn)未檢測到紫硇砂藥材體內(nèi)外特征圖譜，是否由于色譜條件不適宜所致仍有待進(jìn)一步分析?；诖?，本課題組后續(xù)將對復(fù)方述達(dá)格-4全方及各單味藥體內(nèi)外特征圖譜中相對面積較小的峰進(jìn)行指認(rèn)，并對有關(guān)成分體內(nèi)代謝產(chǎn)物進(jìn)行追蹤，從而對復(fù)方述達(dá)格-4進(jìn)行較為全面的分析。

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（收稿日期：2018-02-25 修回日期：2018-04-06）

（編輯：張 靜）