竹堃園，吳蘭，劉燕霏，楊建德

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犬子宮蓄膿中綠膿桿菌分離鑒定及耐藥性分析

竹堃園，吳蘭，劉燕霏通信作者，楊建德通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

為調(diào)查伴侶動(dòng)物化膿性疾病的致病原因，對(duì)來天津農(nóng)學(xué)院附屬動(dòng)物醫(yī)院就診的11歲齡母犬蓄膿子宮膿汁進(jìn)行病原菌的分離、鑒定和耐藥性分析。根據(jù)分離菌菌落形態(tài)觀察、涂片染色鏡檢、生理生化試驗(yàn)、16S rRNA 基因序列分析鑒定結(jié)果表明，該分離菌為綠膿桿菌；藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該分離菌對(duì)氨曲南、頭孢呱酮、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢他啶、氧氟沙星、鏈霉素、卡那霉素、呱啦西林和妥布霉素高度敏感，對(duì)頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢西叮中度敏感，對(duì)氨芐西林、頭孢唑林、頭孢唑吩、麥迪霉素耐藥。研究結(jié)果為防治由綠膿桿菌引起的相關(guān)感染提供參考依據(jù)。

綠膿桿菌；分離鑒定；16S rRNA基因；藥敏試驗(yàn)

綠膿桿菌（）又稱銅綠假單胞菌（），為革蘭氏陰性桿菌假單胞菌屬。1882年首先由Gersard氏從傷口膿液中分離得到[1]，為一種對(duì)人和動(dòng)物均具有感染性的條件性致病菌。在獸醫(yī)臨床上，綠膿桿菌可引起多種臨床病癥：牛乳腺炎、子宮炎，馬流產(chǎn)、化膿性肺炎、蛇壞死性口炎、雛雞敗血癥等；在人醫(yī)臨床上，綠膿桿菌為常見致病菌，能引起術(shù)后及傷口感染，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)人的胸膜炎、肺炎甚至腦膜炎等[2]。近年來，動(dòng)物感染綠膿桿菌引發(fā)疾病的報(bào)道漸多[3-7]。隨著生活質(zhì)量的提高，養(yǎng)伴侶動(dòng)物的人越來越多，寵物帶給人們歡樂的同時(shí)，也傳播人畜共患疾病，嚴(yán)重威脅著畜主的健康，因此，寵物的健康問題成了人們關(guān)注的焦點(diǎn)。細(xì)菌是伴侶動(dòng)物化膿性疾病發(fā)病的一個(gè)主要原因，本文對(duì)一例主要由綠膿桿菌引發(fā)的犬子宮蓄膿病例進(jìn)行研究，以期為防治由綠膿桿菌引起的相關(guān)感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

天津市天津農(nóng)學(xué)院附屬動(dòng)物醫(yī)院于2017年9月14日接收的由天津市某畜主畜養(yǎng)的11歲齡母犬子宮蓄膿病例。

1.1.2 試劑

1.1.2.1 培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基。天津農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制，制備材料均購自杭州生物研究所。

1.1.2.2 腸桿菌科生化鑒定管：蔗糖、枸櫞酸鈉、葡磷胨水、甘露醇、麥芽糖、乳糖、靛基質(zhì)、硫化氫、尿素、半固體瓊脂動(dòng)力生化鑒定管，均購自杭州生物研究所。

1.1.2.3 藥敏紙片：氨芐西林、氨曲南、頭孢唑林、頭孢唑吩、頭孢呋辛、頭孢呱酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢西叮、氧氟沙星、鏈霉素、妥布霉素、卡那霉素、麥迪霉素、呱啦西林均購自杭州微生物試劑公司。

1.1.2.4 Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；DreamTaq-TM DNA Polymerase購自MBI；dNTP購自生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂糖購自BBI；SanPrep 柱式DNAJ膠回收試劑盒、DNA Ladder Mix maker購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2.5 引物：上游引物5＇-AGTTTGATCMTGGC TCAG-3＇；下游引物5＇-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3＇，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

稱取定量配備原料，混勻后定容至1 L，高壓蒸汽滅菌，120～125 ℃，15 min。普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基于超凈臺(tái)倒平板，冷卻后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基冷卻后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病料的采集與分離培養(yǎng)

無菌采取該例犬子宮蓄膿病子宮中的膿汁，劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫保溫箱中培養(yǎng)24 h后，挑取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，分別劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫保溫箱中培養(yǎng)24 h后，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 涂片染色鏡檢

挑取純培養(yǎng)物單個(gè)菌落涂布于載玻片上，革蘭氏染色，置生物顯微鏡低倍鏡（4×）下找到視野后，于油鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)及染色特征。

1.2.4 生理生化試驗(yàn)

挑取純培養(yǎng)物無菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃恒溫保溫箱中培養(yǎng)24 h后得到幼齡菌液，于超凈臺(tái)將幼齡菌液分別接種于蔗糖、枸櫞酸鈉、葡磷胨水、甘露醇、麥芽糖、乳糖、靛基質(zhì)、硫化氫、尿素、半固體瓊脂動(dòng)力10種腸桿菌科生化鑒定管內(nèi)，置于37 ℃恒溫保溫箱中培養(yǎng)24 h后，分析記錄結(jié)果。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

挑取純培養(yǎng)物無菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃恒溫保溫箱中培養(yǎng)24 h后得到幼齡菌液，于超凈臺(tái)用微量移液器吸取150 mL幼齡菌液于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，“T”型棒涂勻，用鑷子無菌夾取17種藥敏紙片均勻等距貼于培養(yǎng)基表面，置于37 ℃恒溫保溫箱中培養(yǎng)24 h后，分析記錄結(jié)果。

1.2.6 分離菌株 16S rRNA 基因序列的PCR擴(kuò)增

按SK8255（細(xì)菌）試劑盒操作說明書提取該菌基因組DNA。以該基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增條帶為1 500 bp。擴(kuò)增體系為：Template（基因組DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（with Mg2+）2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL，酶0.2 μL，F(xiàn)（10 μmol/L） 0.5 μL，R（10 μmol/L）0.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL。PCR循環(huán)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃恢復(fù)延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA、20 min電泳觀察。最終送生工生物工程（上海）股份有限公司純化、測(cè)序。測(cè)序引物為：5＇-AGTTTGATCMTGGCTCAG - 3＇；5＇-GGTTACCTTGTTACGACT T-3＇。

1.2.7 分離菌株16S rRNA基因序列同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

16S rRNA基因序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLast比對(duì)，獲取與分離菌株最為相近的序列，在DNAstar軟件上進(jìn)行多序列同源性比對(duì)、分析，最后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 菌落培養(yǎng)形態(tài)特征

在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成淺綠色、圓形、光滑濕潤、邊緣呈波狀的中等大小菌落；培養(yǎng)基也呈黃綠色，數(shù)日后，培養(yǎng)基的綠色逐漸變深（圖1）。麥康凱培養(yǎng)基上形成外周透明中間淺灰色，大頭針頂大的圓形菌落。血液瓊脂培養(yǎng)基上形成灰色，中心較暗，呈β溶血的不規(guī)則圓形大菌落（圖2）。

圖1 分離菌普通營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)圖

圖2 分離菌血液瓊脂平板培養(yǎng)圖

2.2 涂片染色鏡檢

油鏡下可見到單在、成對(duì)或者連接呈短鏈狀中等大小的革蘭氏染色陰性桿菌（圖3）。

圖3 分離菌顯微鏡下觀察結(jié)果

2.3 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)該菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果見表1，該分離菌株不分解蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇；不產(chǎn)生靛基質(zhì)；不利用尿素；MR、VP試驗(yàn)均呈陰性；能利用枸櫞酸鈉；產(chǎn)生硫化氫。參照標(biāo)準(zhǔn)菌株生理生化特性，該分離菌與綠膿桿菌基本一致，初步判定該分離菌為綠膿桿菌。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

注：“＋”陽性；“－”陰性

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)該菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2，根據(jù)CLSI藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，分為耐藥（R）、中度敏感（I）、高度敏感（S）。結(jié)果表明該分離菌對(duì)氨曲南、頭孢呱酮、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢他啶、氧氟沙星、鏈霉素、卡那霉素、呱啦西林、妥布霉素高度敏感，對(duì)頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢西叮中度敏感，對(duì)氨芐西林、頭孢唑林、頭孢唑吩、麥迪霉素耐藥。

表2 藥敏試驗(yàn)判定結(jié)果

注：“R”耐藥；“I”中度敏感；“S”高度敏感

2.5 分離菌株16S rRNA 基因序列的PCR擴(kuò)增

分離菌16S rRNA基因序列的PCR擴(kuò)增電泳顯示該菌的基因擴(kuò)增片段長度約為1 480 bp，預(yù)擴(kuò)增片段長度為1 500 bp，與預(yù)期片段長度一致。

2.6 分離菌株16S rRNA基因序列同源性分析

分離菌經(jīng)測(cè)序獲得的基因序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLast比對(duì)，獲取13株相近參考序列。將分離菌株16S rRNA基因序列經(jīng)DNAStar軟件中的Megalign分別與該13株16S rRNA 基因序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明，分離菌株的16S rRNA基因序列與該13株綠膿桿菌的16S rRNA基因序列具有極高的同源性，同源性均在99%以上，見圖4。

圖4 16S rRNA基因序列與參考序列同源性比較結(jié)果

2.7 分離菌珠系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將分離菌株的16S rRNA基因序列經(jīng)DNAStar軟件中的Megalign與13株相近序列通過Neighbor-Joining法進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建。由進(jìn)化樹分析得分離菌株與KX268504.1的親緣性最近，而與數(shù)據(jù)庫中的MG585077.1、KM894176.1親緣性相對(duì)較遠(yuǎn)，見圖5。

圖5 16S rRNA基因序列與參考序列構(gòu)建進(jìn)化樹結(jié)果

3 討論

綠膿桿菌是一種人獸感染的重要條件致病菌，可感染包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物。伴侶動(dòng)物與人類共享一個(gè)生活環(huán)境，它們或是易感，或是在疾病傳播中發(fā)揮作用[8]。本次研究，分離菌落在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的生長形態(tài)特征及革蘭氏染色鏡檢結(jié)果與韓青松等研究報(bào)道中提到的綠膿桿菌形態(tài)和培養(yǎng)特征一致[9]。生理生化試驗(yàn)結(jié)果與牛鐘相等研究報(bào)道中提到的綠膿桿菌生化特性一致[1]。16S rRNA基因測(cè)序是目前用于鑒定菌株種類的最普遍的分子技術(shù)[10]，分離菌16S rRNA 基因分子序列與參考綠膿桿菌16S rRNA基因分子序列同源性高達(dá)99%，結(jié)合菌落形態(tài)觀察、涂片染色鏡檢、生理生化試驗(yàn)、16S rRNA 基因序列分析鑒定最終將該分離自犬子宮蓄膿病子宮膿汁中的菌株判定為綠膿桿菌。

此次藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該分離菌對(duì)氨曲南、頭孢呱酮、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢他啶、氧氟沙星、鏈霉素、卡那霉素、呱啦西林、妥布霉素高度敏感，但對(duì)頭孢曲松中度敏感，對(duì)氨芐西林、頭孢唑林、頭孢唑吩、頭孢呋辛、頭孢西叮、麥迪霉素耐藥。這與吳文德等報(bào)道的眼鏡蛇腐皮病病原菌第1、15號(hào)菌對(duì)該17種藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果基本一致[3]，只有對(duì)頭孢曲松、氧氟沙星、卡那霉素的耐藥性發(fā)生了變化，這可能與該犬前期診斷用藥或試驗(yàn)誤差有關(guān)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，可選擇敏感性極高的頭孢呱酮、頭孢噻肟為治療藥物。由藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知其耐藥性廣泛，這與張祎博等報(bào)道的2005—2014年CHINET銅綠假單胞菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果一致[11]。很多因素導(dǎo)致了細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性，在獸醫(yī)臨床上主要是抗生素的不合理使用或?yàn)E用[4]。綠膿桿菌對(duì)抗生素的敏感性總體上呈逐年下降的變化趨勢(shì)[12]。因此，對(duì)該菌的耐藥性檢測(cè)是臨床用藥的重要參考指標(biāo)，為使綠膿桿菌病得到快速有效的治療及延緩耐藥性的產(chǎn)生，獸醫(yī)臨床上不僅需要根據(jù)耐藥性檢測(cè)結(jié)果選擇最有效的治療藥物，還需要嚴(yán)格控制抗生素的使用，避免同一抗生素的長期使用。

伴侶動(dòng)物化膿性疾病為獸醫(yī)臨床上常見疾病，病灶區(qū)含有多種人畜共患病原菌，人類一旦接觸此類攜帶人畜共患病原菌的患病動(dòng)物而不注意消毒衛(wèi)生，就可能引起發(fā)病。有報(bào)道表明，犬發(fā)情后期，黃體大量分泌孕酮，這時(shí)母犬子宮對(duì)細(xì)菌感染最為敏感[13]。受孕酮濃度增加和雌激素濃度降低的影響，子宮免疫力下降，犬發(fā)情后期經(jīng)開張的子宮頸進(jìn)入子宮的致病菌，此時(shí)極易大量增殖，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎，最終引起子宮蓄膿[14]。因此，本例犬子宮蓄膿疾病判斷病因?yàn)槿l(fā)情后期在孕酮和雌激素的預(yù)作用下，銅綠假單胞菌在子宮內(nèi)大量滋生造成的。臨床上子宮蓄膿病例分離到的細(xì)菌主要是大腸桿菌[15]，此外還有肺炎克雷伯氏菌、鏈球菌、糞腸球菌、假單胞桿菌、葡萄球菌等[16-17]，對(duì)綠膿桿菌引起的子宮蓄膿報(bào)道較少，此次研究豐富了綠膿桿菌的研究數(shù)據(jù)，也為防治由該菌引起的相關(guān)感染提供參考。為了降低動(dòng)物及人的受感染概率，畜主應(yīng)當(dāng)定期做清潔工作，嚴(yán)格接種疫苗，發(fā)病后及時(shí)接受治療。

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責(zé)任編輯：張愛婷

Isolation, identification and susceptibility analysis offrom a canine pyometra

ZHU Kun-yuan,WU Lan, LIU Yan-feiCorresponding Author, YANG Jian-deCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In order to clarify the causes of the fester disease in companion animals, the study involved isolation, identification and drug susceptibility analysis of pathogenic bacteria from an 11-year-old female dog’s uterus who were admitted to the veterinary hospital of Tianjin Agricultural University. According to the results of colony morphology, smear staining microscopy, physiological and biochemical reaction and 16S rRNA gene analysis, the bacteria was identified as a. Susceptibility analysis showed that the isolate is highly sensitive to aztreonam, cefdinir, cefotaxime, cefepime, ceftazidime, ofloxacin, streptomycin, kanamycin, piperacillin and tobramycin. Moreover, this isolate is moderately sensitive to ceftriaxone, cefuroxime and cefoxitin, but resistant to ampicillin, cefazolin, cefazine and medemycin. The research results provided references for controlling infection caused by.

; isolation and identification; 16S rRNA gene; susceptibility analysis

1008-5394（2018）03-0047-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.03.010

S852.611

A

2018-03-26

天津農(nóng)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（201710061193）；天津自然科學(xué)基金項(xiàng)目（07JCYBJC16000）

竹堃園（1996-），女，本科在讀，研究方向：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail：824771063@qq.com。

劉燕霏（1970-），女，副教授，碩士，研究方向：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail：674383573@qq.com。

楊建德（1969-），男，教授，博士，研究方向：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail：jiandeyang@126.com。