郝祥瑜　毛增輝　任華　陶瑞松

摘 要 對我國冰清絹蝶主要地理分布區(qū)的10個地理居群200個體翅脈脈相的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測量統(tǒng)計和聚類分析，以期探討幾何形態(tài)學(xué)方法在研究蝶類昆蟲種內(nèi)居群間分化的可行性和有效性。

關(guān)鍵詞 冰清絹蝶 地理居群 翅脈特征 幾何形態(tài)學(xué) 系統(tǒng)分類

中圖分類號 Q-9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 B

在傳統(tǒng)昆蟲分類學(xué)中，昆蟲的翅脈特征是一個非常重要的分類學(xué)指標(biāo)。它不僅對昆蟲的分類鑒定有重要意義，還可以應(yīng)用于對昆蟲的物種多樣性、系統(tǒng)發(fā)生發(fā)育及昆蟲在不良環(huán)境條件下所發(fā)生的變異程度的研究。

幾何形態(tài)學(xué)是關(guān)于形態(tài)定量比較的科學(xué)計算工具，是用數(shù)學(xué)方法描述或分析一個圖像形狀結(jié)構(gòu)的方法。其研究方法多種多樣，但都需要先將形態(tài)數(shù)據(jù)數(shù)字化，再比對不同的樣本，通過比對計算出樣本之間的形狀和大小差距，意在找到樣本之間的“同源信號”和“簡約信息位點”。通過比對篩選出有效生物學(xué)性狀，再用統(tǒng)計學(xué)的方法統(tǒng)計聚類。在國外，幾何形態(tài)學(xué)方法已廣泛應(yīng)用于探討生物的個體發(fā)育、種群分化、系統(tǒng)進(jìn)化等多個方面，研究對象以大動物居多。在國內(nèi)，僅用于昆蟲的分類鑒定及遠(yuǎn)程自動識別研究中。目前國內(nèi)隨著計算機(jī)圖像處理技術(shù)的不斷發(fā)展，以昆蟲翅脈特征提取為核心技術(shù)的軟件也日趨完善，圖像數(shù)字化處理技術(shù)與傳統(tǒng)昆蟲形態(tài)學(xué)結(jié)合已經(jīng)充分應(yīng)用到昆蟲種間的分類鑒定中，但是運(yùn)用幾何形態(tài)學(xué)方法研究蝶類昆蟲種內(nèi)居群間分化國內(nèi)外鮮有報道。

絹蝶屬（Parnassius），是絹蝶亞科絹蝶族中的一個屬，物種繁多，廣泛分布于古北界及新北界溫帶的高山地區(qū)，從巴基斯坦到中亞和中國，部分物種擴(kuò)至到歐州、日本及北美洲，因物種分布廣，各地理因素如山脈、海洋、河流等導(dǎo)致物種隔離，繼而演化出許多亞種。我國絹蝶資源豐富，據(jù)周堯《中國蝶類志》記載：全世界絹蝶有38種，僅我國就有35種，124亞種。主要產(chǎn)于高山上，耐寒力強(qiáng)，少數(shù)種類分布在低海拔，寄主植物是景天科及紫堇、延胡索等。冰清絹蝶（Parnassius glacialis Butler）是分布在低海拔地區(qū)的絹蝶，也是我國江南分布的唯一一種絹蝶，這可能是第四紀(jì)冰期的遺留物種，分布于河南、山東、陜西、湖北、安徽、浙江、江蘇、甘肅等地。寄主植物單一，主食罌粟科紫堇屬的延胡索和小藥八旦子。其形態(tài)學(xué)特征：體黑色，披有黃色長毛，頸部有1輪黃色毛叢。翅色白而稍呈蠟黃，翅質(zhì)薄而半透明，溫潤如絲絹，翅脈灰黑褐色。前翅亞外緣有1條褐色帶紋，中室內(nèi)和中室端各有1個黑褐色斑紋，后翅內(nèi)緣的黑帶較寬。

生物地理學(xué)是生物學(xué)和地理學(xué)間的邊緣學(xué)科，研究生物在時空上的分布及闡釋物種的地理分布為何呈現(xiàn)如今格局的學(xué)科。下面嘗試通過對不同地理居群冰清絹蝶翅脈特征的幾何形態(tài)學(xué)計量，推測冰清絹蝶現(xiàn)有分布格局的形成機(jī)制，旨為相關(guān)領(lǐng)域研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取冰清絹蝶10個地理居群的標(biāo)本（每一居群隨機(jī)抽樣20個體），涵括了冰清絹蝶的大部分分布區(qū)，具體的采樣點信息見表1。野外采集的標(biāo)本立即投入無水乙醇中保存，所取標(biāo)本均來源于安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子系統(tǒng)學(xué)與進(jìn)化研究室樣品庫

1.2 標(biāo)本處理

取出浸泡在無水乙醇中的蝴蝶，用鑷子夾取蝶翅的基部，使其完整地脫落，待酒精揮發(fā)完全，在蝶翅下方置墊一小方塊白紙，便于與黑色翅脈形成反差；蓋上載玻片，將蝶翅壓平，放入基恩士VHX-5000三維數(shù)碼顯微鏡中觀察測量（分辨率2 400 DPI）。

1.3 圖像獲取

利用基恩士VHX-5000三維數(shù)碼顯微鏡的圖像拼接技術(shù)對圖像進(jìn)行采集，形成一張完整的蝴蝶全翅圖片，在該數(shù)碼顯微鏡的測量工具中，利用鼠標(biāo)多點連線或兩點間連線描摹出翅脈的紋路并且勾勒出所需測量的翅脈長度和面積，即可進(jìn)行測量。前翅共測得13組數(shù)據(jù)，后翅共測得4組數(shù)據(jù)，保存拍攝圖片以及測量結(jié)果生成擴(kuò)展名為.csv的文件，利用VHX Measurement Data Tabulation Tool軟件將數(shù)據(jù)導(dǎo)出至Excel表格中。

1.4 數(shù)據(jù)分析

在Excel表格中，整理和統(tǒng)計10個居群共200個絹蝶所測得的翅脈長度和面積，并求出均值，對翅脈長度、蝶翅中室面積、全翅面積等性狀進(jìn)行統(tǒng)計分析，利用SPSS 21.0軟件分別對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行初步系統(tǒng)聚類，篩選出聚類結(jié)果相同的一些性狀，舍棄部分不適合聚類分析的性狀，最后對篩選出的性狀進(jìn)行統(tǒng)計和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 10個冰清絹蝶地理居群的翅脈形態(tài)學(xué)特征平均值

分別取10個地理居群各20個冰清絹蝶，測量前翅11組長度數(shù)據(jù)、2組面積數(shù)據(jù)；測量后翅2組長度數(shù)據(jù)、2組面積數(shù)據(jù)（圖1）。求得前后翅翅脈形態(tài)學(xué)特征平均值（表2，表3），表2為前翅翅脈數(shù)據(jù)，表3為后翅翅脈數(shù)據(jù)。根據(jù)Excel文檔求出P值結(jié)果小于0.05，表示各特征值的不同均由不同居群的冰清絹蝶的形態(tài)差異引起。

從表中可以看出南京、連云港、天堂寨、天目山的冰清絹蝶蝶翅面積較大，各翅脈長度相對較長。利用SPSS 21.0對前后翅共計17組數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，并一一比對，選出聚類分析較為相似的數(shù)據(jù)共10組，即為有效性狀。

2.2 十個冰清絹蝶地理居群的聚類分析樹狀圖

利用SPSS 21.0再將10組有效性狀（前翅分別為ab、R1、R5、M1、Cu2、2A、af、中室面積；后翅分別為ab、中室面積）進(jìn)行聚類分析，繪制出樹狀圖（圖2），從樹狀圖得出結(jié)論：冰清絹蝶的演化劃分為兩支，聚為兩大類，一類為天堂寨、南京、天目山、連云港四個地理居群；另一類為瑯琊山、泰山、嵩山、天水、黃柏塬、神農(nóng)架六個地理居群。聚為一類的顯示親緣關(guān)系較近。

2.3 冰清絹蝶演化路徑推測圖

根據(jù)2.2聚類樹狀圖繪制成冰清絹蝶演化路徑的推測圖（圖3）。地質(zhì)學(xué)資料顯示，大約60百萬年以前，印度板塊和亞歐板塊碰撞導(dǎo)致的造山運(yùn)動逐漸形成了青藏高原，包括喜馬拉雅山脈。同時，相關(guān)的分子系統(tǒng)學(xué)和分子鐘研究推測，距今大約20～30百萬年前，絹蝶屬物種的祖先在我國西南地區(qū)（現(xiàn)今藏東南的橫斷山脈一帶）開始形成，同時產(chǎn)生了一些適應(yīng)高海拔環(huán)境的特性，如身翅被毛，耐寒冷、耐低氧等，隨著絹蝶屬的分化和物種之間的競爭，以及中新世以后，特別是第四紀(jì)期間全球氣候變化的影響，冰清絹蝶開始向華中、華北、華東地區(qū)遷移，形成兩支演化路徑：一支由喜馬拉雅山脈經(jīng)過唐古拉山、巴顏喀拉山，到達(dá)位于秦嶺的天水、黃柏塬、神農(nóng)架一帶，再分為三小支，途經(jīng)華北平原分別向泰山、嵩山、瑯琊山三個方向遷移；另一支由喜馬拉雅山脈發(fā)源，向東遷移經(jīng)過秦嶺、四川盆地到達(dá)天堂寨、南京、天目山等地，最后沿海岸線擴(kuò)散至連云港一帶。成為我國唯一一種分布到長江以南，生活在較低海拔地區(qū)的絹蝶，且對生活環(huán)境要求極為苛刻。

3 討論

安徽天堂寨位于大別山區(qū)，是南北水系的分水嶺，屬大別山系，地質(zhì)基礎(chǔ)為前震旦紀(jì)的秦嶺褶皺帶，后期受燕山期造山運(yùn)動的顯著影響；浙江天目山和江蘇南京紫金山總體上屬于寧鎮(zhèn)山脈，是侏羅紀(jì)末到白堊紀(jì)初期，通過寧鎮(zhèn)山脈造山運(yùn)動而形成的一條向北突出的弧形皺；江蘇連云港云臺山的地質(zhì)基礎(chǔ)則屬于華北古陸構(gòu)架。這些古地質(zhì)事件形成的山脈后來都經(jīng)過了頻繁的地質(zhì)變化過程才最終形成了現(xiàn)在的地質(zhì)地貌。

甘肅天水屬小隴山系，為秦嶺的西北緣；陜西黃柏塬地為秦嶺腹地；湖北神農(nóng)架屬大巴山系，河南嵩山屬伏牛山系，它們都是秦嶺造山帶的余脈；山東泰山構(gòu)造基礎(chǔ)為古華北地帶，后來經(jīng)漫長而又復(fù)雜的演化過程才形成今天的地貌；安徽瑯琊山為江淮之間的低山丘陵地帶，系大別山系向東延伸而成的余脈。

總之，上述地質(zhì)過程，包括較晚近的燕山運(yùn)動時期（在地史上主要屬于侏羅紀(jì)末到古近紀(jì)初這段時期，距今約2億1千萬年開始到6 500萬年前為止）相對于絹蝶種群的分化時期而言（據(jù)分子鐘推測為350萬前至30萬年前）是一個十分古老的時期，因而，這些地質(zhì)因素對冰清絹蝶的擴(kuò)散無關(guān)。

綜合多方面證據(jù)分析，筆者推測，冰清絹蝶不同居群間的擴(kuò)散路徑與其地理分布（相關(guān)山脈分布、走向及地理隔離等）之間有明顯的相關(guān)性，即地質(zhì)歷史上，第四紀(jì)開始至今的地質(zhì)、生物環(huán)境和氣候變化因素對冰清絹蝶的擴(kuò)散路徑和現(xiàn)代地理分布產(chǎn)生了重要影響。譬如，第一進(jìn)化支（天堂寨、天目山、南京、連云港四個地理居群）各居群的生態(tài)環(huán)境極為相似，均位于華北平原與長江中下游平原地帶，海拔較低，降水豐富，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候與溫帶季風(fēng)氣候交界處；而第二進(jìn)化支（天水、黃柏塬、神農(nóng)架、嵩山、泰山五個地理居群）的生態(tài)環(huán)境類似，海拔相對較高、氣溫也相對較低，地處內(nèi)陸，降水相對較少。至于安徽瑯琊山的居群，單從地理因素考慮，理論上應(yīng)屬于第一進(jìn)化支，這與安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子系統(tǒng)學(xué)與進(jìn)化研究室利用分子手段分析的結(jié)果基本一致（實驗結(jié)果暫未發(fā)表）。但從形態(tài)上看，瑯琊山居群確實很特殊（如后翅基部較大范圍明顯的黑色斑塊，體毛為灰白色），且和嵩山或泰山等高緯度地區(qū)的居群極為相似。筆者推測這有可能受其寄主植物及采蝶時（2013年4月29日）當(dāng)年的氣候影響，因為不同氣候（如陰雨、干旱、季節(jié)變化等），寄主植物均影響蝶類個體發(fā)生和發(fā)育。

筆者查閱了冰清絹蝶寄主植物和氣象的相關(guān)資料。資料顯示，延胡索是瑯琊山冰清絹蝶的唯一寄主植物，且大都分布在瑯琊山山頂（海拔200～300 m），且蝶類對寄主植物專一性較強(qiáng)。雖然它們有一定的遷飛能力，但其分布仍然以寄主為中心。據(jù)文獻(xiàn)記載，延胡索瑯琊山居群的6種主要異喹啉生物堿含量在河南、安徽、浙江、江蘇、江西等12個居群中大都高于其它居群含量。尤其是紫堇堿含量最高（0.44%），比含量最低的江西宜興大灘嶺居群（0.024%）高近20倍，同時延胡索對環(huán)境要求很嚴(yán)，對于低洼易積水及水分較少的干旱地段都不適合其生長，生長期僅有3個月，一般分布在海拔200～800m的丘陵山區(qū)的半陰坡，系早春植物[20]；同時從安徽滁州氣象站提供氣象資料和中央氣象局?jǐn)?shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示，瑯琊山地區(qū)2013年3、4月降水量均為18.4 mm，與近三十年同期均值相比，偏少7成；日照均為240 h，與常年相比偏多4成，整體氣候近為春旱，冰清絹蝶與其寄主植物休戚相關(guān)。所以，瑯琊山居群獨特的翅脈形態(tài)特征可能與其寄主植物和當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件等都有密切關(guān)系。

4 小結(jié)

通過對10個不同地理居群冰清絹蝶翅脈幾何形態(tài)學(xué)的初步分析顯示，冰清絹蝶不同居群間的擴(kuò)散路徑與其地理分布之間有著明顯的相關(guān)性，其擴(kuò)散路徑及進(jìn)化有兩個分支，聚為兩大類：一支是天堂寨、天目山、瑯琊山、南京、連云港五個地理居群聚為一類，顯示親緣關(guān)系近；一支是天水、黃柏塬、神農(nóng)架、泰山、嵩山五個地理居群聚為一類，顯示親緣關(guān)系近。本研究完全支持安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子系統(tǒng)學(xué)與進(jìn)化研究室利用分子手段分析的結(jié)果。研究結(jié)果表明，幾何形態(tài)學(xué)分析方法在蝶類的種內(nèi)分化研究中也是一種十分可行簡易的有效手段，對于探討生物的個體發(fā)育、種群分化、系統(tǒng)進(jìn)化等多方面很有意義和價值。

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