楊銀菊 陳愛國 劉光亮 張彥 王樹聲

摘要 綠原酸是重要的植物苯丙素類次生代謝產(chǎn)物之一，與植物的食品風(fēng)味和藥用生物活性等密切相關(guān)，其生物合成與調(diào)控研究一直是科研人員所關(guān)注的焦點(diǎn)。本文綜述了煙草綠原酸生物合成途徑中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)苯丙氨酸解氨酶基因、肉桂酸-4-羥化酶基因、對-香豆酸輔酶A連接酶基因、羥基肉桂酰輔酶A：奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因、羥基肉桂酰輔酶A莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因、對-香豆酸3′-羥化酶基因的研究進(jìn)展，并進(jìn)一步展望了煙草綠原酸生物合成代謝調(diào)控的研究方向，旨在為煙草綠原酸生物合成途徑的深入研究和定向調(diào)控提供參考。

關(guān)鍵詞 煙草；綠原酸；生物合成；關(guān)鍵酶；基因

中圖分類號 S572 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）13-0005-04

Research Progress on Key Enzyme Genes in Chlorogenic Acid Biosynthesis Pathway

YANG Yin-ju 1，2，3 CHEN Ai-guo 1，2 LIU Guang-liang 1，2 ZHANG Yan 1，2 WANG Shu-sheng 1，2 *

（1 Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Qingdao Shandong 266101； 2 Key Laboratory of Tobacco Biology and Processing，Ministry of Agriculture； 3 Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences）

Abstract Chlorogenic acid is one of the important phenylpropanoids formed by plants secondary metabolism，which is closely related to plant food flavor and medical biological activity. Accordingly，the researches on the chlorogenic acid biosynthetic pathway and its regulation have been the focus of researchers.In this paper，considering the biosynthesis pathway of tobacco chlorogenic acid，we described the molecular regulations of the key nodes containing phenylalanine ammonia-lyase gene，cinnamic acid 4-hydroxylase gene，4-coumarate-CoA ligase gene，Hydroxycinnamoyl-CoA：quinate hydroxycinnamoyl transferase gene，hydroxycinnamoyl CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransferase gene，and ρ-coumaroylester 3′-hydroxylases gene.Additionally，the future researches on metabolic regulation of tobacco chlorogenic acid biosynthesis were further prospected，in order to provide reference for better understand the biosynthetic mechanism of tobacco chlorogenic acid and its regulation.

Key words tobacco；chlorogenic acid；biosynthesis；key enzyme；gene

綠原酸（chlorogenic acid，CGA）在植物界中廣泛存在，主要分布于忍冬科、菊科、杜仲科和茄科[1]。煙草（Nicotiana tabacum L.）是茄科煙草屬植物，其綠原酸含量可達(dá)3%[2]，相對較高。煙草中，綠原酸除了本身具有清香風(fēng)味之外，還可以在多酚氧化酶等的作用下生成吡嗪、吡啶、吡咯類等有堅(jiān)果香物質(zhì)[3]，賦予煙草制品優(yōu)雅的香氣，增加煙草制品的香氣量。此外，綠原酸分子含有不飽和雙鍵、酯鍵與多元酚等，是重要的天然抗氧化劑，與植物細(xì)胞對低溫、紫外線以及病害等非生物和生物抗性密切相關(guān)[1，4]。因此，研究煙草中綠原酸的生物合成與積累對提高煙草品質(zhì)和抗逆性具有重要意義。目前，煙草中的綠原酸生物合成途徑及其關(guān)鍵酶基因研究主要集中在酶活性與煙株抗逆活動之間的關(guān)系，而對該途徑中關(guān)鍵基因的特征和功能及其與烤煙品質(zhì)形成關(guān)系研究較少。因此，本文綜述了煙草綠原酸生物合成途徑及其關(guān)鍵酶基因的研究進(jìn)展，為定向調(diào)控?zé)煵葜芯G原酸的生物合成從而改善烤煙品質(zhì)提供參考。

1 煙草綠原酸生物合成途徑

綠原酸是咖啡酸與奎尼酸的反應(yīng)產(chǎn)物。煙草中，綠原酸主要在葉片中合成[5]。目前，普遍認(rèn)為綠原酸的生物合成主要有2條途徑：一是HQT催化咖啡酰輔酶A和奎尼酸通過酯交換合成綠原酸[6]（圖1，Ⅰ）；二是咖啡酰苷作物活性中間體與奎寧酸酯交換生產(chǎn)綠原酸[7]（圖1，Ⅱ）。也有報道認(rèn)為，存在第3條可能的途徑，即在HCT的催化下生成對-香豆?？崴幔S后經(jīng)C3H羥基化作用生成綠原酸[1]（圖1，Ⅲ）；然而，在擬南芥中HCT和C3H均有活性時，并不積累綠原酸，使得綠原酸的該生物合成途徑是否存在受到質(zhì)疑[1]。

2 煙草綠原酸生物合成關(guān)鍵酶基因

2.1 苯丙氨酸解氨酶基因

苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）是苯丙烷代謝途徑的第一個關(guān)鍵酶，催化苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸（圖1），是連接初生代謝和次生代謝的關(guān)鍵酶（表1）。因此，PAL在植物生長發(fā)育、應(yīng)激防御中起關(guān)鍵作用。許多涉及苯丙烷途徑的應(yīng)激反應(yīng)可以誘導(dǎo)PAL活性。本課題組研究表明，4 ℃低溫處理后，烤煙品種K326和紅花大金元PAL活性分別增加163.95%和159.39%；NaCl脅迫處理后K326和紅花大金元PAL分別增加126.29%和129.24%，增強(qiáng)了紅花大金元材料中隱綠原酸合成代謝及K326材料中綠原酸合成代謝[8]。光照也可刺激PAL活性；遮蔭可以抑制PAL的活性，白光處理后 PAL活性遠(yuǎn)大于其他光質(zhì)處理，藍(lán)光處理明顯降低了PAL活性[9]。PAL基因在響應(yīng)生物和非生物脅迫如機(jī)械損傷、低溫、病原物侵染、缺素和信號物質(zhì)（茉莉酸、水楊酸、脫落酸）處理時主要受轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控[10]。法國豆的3個PAL基因的轉(zhuǎn)錄水平均受機(jī)械損傷誘導(dǎo)[11]。

在植物中，苯丙氨酸解氨酶是多基因家族編碼的。例如，楊樹[12]PtrPAL基因家族由5個成員（PtrPAL1-5）組成，黃瓜[13]PAL家族有7個成員，番茄[14]PAL數(shù)目多達(dá)26個，擬南芥[15]和煙草中均有4個PAL基因。煙草的4個PAL基因分成2個亞家族，NtPAL1和NtPAL4為一個亞家族，NtPAL2和NtPAL3為一個亞家族，并且這4個基因在根、莖、葉、花中均有表達(dá)，其中NtPAL4在雄蕊、木質(zhì)部和根中表達(dá)量較高，但在莖、髓組織中幾乎檢測不到；除木質(zhì)部和葉片外，所有組織中的NtPAL2轉(zhuǎn)錄水平均低于NtPAL1和NtPAL3；大多數(shù)NtPAL在成熟葉和髓中表達(dá)水平較低[11]。

2.2 肉桂酸-4-羥化酶基因

肉桂酸-4-羥化酶（cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H），屬于細(xì)胞色素P450單加氧酶CYP73家族，催化肉桂酸生成香豆酸。C4H的表達(dá)和活性受光線、病原物和機(jī)械損傷等諸多因素的調(diào)控[16]，研究表明，適度遮蔭有利于提高K326和紅花大金元的C4H活性，遮蔭程度較高時（44%自然光），2個品種C4H活性均受到抑制[9]。4 ℃低溫處理后，K326和紅花大金元C4H活性分別增加218.83%和189.36%。此外，NaCl處理也能提高C4H活性[8]。

C4H主要參與木質(zhì)素生物合成。桉樹C4H表達(dá)下調(diào)木質(zhì)素含量降低[17]。在苜蓿中，C4H表達(dá)下調(diào)的植株不僅木質(zhì)素含量降低，而且S/G比值也降低[18]。煙草C4H表達(dá)下調(diào)也表現(xiàn)出相似的現(xiàn)象[19]。青蒿C4H基因沉默植株反式肉桂酸積累，香豆酸、總酚、花青素、C4H和PAL活性降低[20]。Huang等[21]研究表明，防御/應(yīng)激途徑的信號成分子如茉莉酸甲酯（MJ）、脫落酸（ABA）和紫外線B輻射（UV-B）可刺激丹參SmC4H轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。

C4H已在普通煙草中得到克隆，本課題組[22]克隆得到了K326和紅花大金元烤煙品種NtC4H1和NtC4H2基因的全長cDNA序列，開放閱讀框均為1 518 bp，編碼505個氨基酸（表1）。并且發(fā)現(xiàn)NtC4H1和NtC4H2在2個品種中表達(dá)模式存在差異。

2.3 4-香豆酸輔酶A連接酶基因

4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL），催化對香豆酸生成對香豆酰輔酶A。除了對香豆酸之外，4CL異構(gòu)體能夠利用多種羥基肉桂酸衍生物作為底物，例如4CL可以催化咖啡酸生成咖啡酸輔酶A，以阿魏酸作為底物生成阿魏酰輔酶A。由于4CL處于初級苯丙烷代謝的終端位置以及能夠利用多種相關(guān)底物，因而4CL在碳源流入苯丙烷代謝的特定分支起關(guān)鍵作用[23]。

4CL以基因家族的形式存在，在擬南芥中編碼4CL酶的基因有3個，即At4CL1、At4CL2和At4CL3[24]。而在普通煙草中則由Nt4CL1和Nt4CL2 這2個基因編碼4CL[25]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，4CL基因通常被分為2個不同的基因簇（Class Ⅰ和Class Ⅱ），它們在單子葉植物和雙子葉植物中具有不同的生理功能[26]。Class Ⅰ 4CLs參與木質(zhì)素和其他結(jié)構(gòu)相關(guān)的苯丙素衍生物的生物合成，而Class Ⅱ 4CLs參與類黃酮生物合成[27-28]。Class Ⅰ 4CLs表達(dá)模式在不同物種木質(zhì)化區(qū)域基本一致。例如，擬南芥[29]At4CL1和At4CL2主要局限于維管束組織，白楊[30] Pt4CL1主要在木質(zhì)部中表達(dá)。通過檢測mRNA的積累和啟動子活性發(fā)現(xiàn)馬鈴薯（Solanum tubero-sum）[31]，煙草（Nicotiana tabacum）[32]和水稻（Oryza japonica）[33]Class Ⅰ 4CLs也具有相似的表達(dá)模式。Class Ⅱ 4CLs表達(dá)通常在花和非木質(zhì)化組織。楊樹[30] Pt4CL2優(yōu)先在葉和莖的表皮及花中表達(dá)。擬南芥花、成熟葉、長角果、莖和根中也已經(jīng)檢測到At4CL3的表達(dá)[34]。

有研究表明，將4CL1基因轉(zhuǎn)入到煙草中，會抑制煙草內(nèi)源4CL基因表達(dá)，使得4CL活性降低，4CL的代謝底物積累[35]。CaMV啟動子35S正義融合4CL1轉(zhuǎn)基因煙草葉片和莖4CL酶活性增加，木質(zhì)素含量增加；sjGRP1.8正義融合4CL1轉(zhuǎn)基因煙草中葉片4CL酶活性未見增加，而莖4CL活性提高，葉片木質(zhì)素含量與未轉(zhuǎn)基因植株沒有差異，而莖部木質(zhì)素含量增加25%[36]。Pt4CL1正義轉(zhuǎn)基因煙草葉片及莖中酶活性和木質(zhì)素含量分析也得到了相似的結(jié)果[37]。

本課題組[22]克隆得到K326和紅花大金元烤煙品種Nt4CL1和Nt4CL2全長cDNA序列，開放閱讀框（ORF）長度分別為1 644 bp和1 629 bp（表1）。同時研究發(fā)現(xiàn)，Nt4CL在木質(zhì)部的表達(dá)高于韌皮部。在適熟期紅花大金元和K326， 4CL活性大小均表現(xiàn)為中部葉>下部葉>上部葉，這與Nt4CL1在不同組織中表達(dá)水平一致。

2.4 羥基肉桂酰輔酶A：奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因

羥基肉桂酰輔酶A：奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（Hydrox-ycinnamoyl-CoA：quinate hydroxycinnamoyl transferase，HQT），是綠原酸生物合成最后一步的關(guān)鍵酶，催化咖啡酰輔酶A和奎尼酸進(jìn)行酯交換生成CGA。HQT、HCT屬于BAHD超家族的一大類?；?輔酶A-依賴的酰基轉(zhuǎn)移酶，具有?；荏w的特異性。研究發(fā)現(xiàn)，HQT基因與HCT基因是緊密連鎖的，并且HQT與HCT可以催化香豆酰莽草酸與香豆酰奎尼酸酯的生物合成[38]。HQT是綠原酸生物合成所必需的酶。在煙草植株中瞬時表達(dá)或在番茄中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化使HQT基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致綠原酸含量顯著降低（在番茄中減少高達(dá)98%）。相反，煙草和番茄植株過表達(dá)HQT后綠原酸水平大幅提高[38]。利用高效液相色譜法（HPLC）測定咖啡綠原酸含量，結(jié)合RT-qPCR分析綠原酸合成關(guān)鍵酶基因HCT、HQT、C3H1和CCOAOMT1在不同組織中的表達(dá)量，結(jié)果表明，HQT高表達(dá)與綠原酸積累有關(guān)[39]。RNAi抑制HQT基因表達(dá)導(dǎo)致CGA減少90%和早花[40]。此外，該研究還表明，HQT和PAL之間存在一個調(diào)節(jié)回路，在HQT被抑制的路徑上觀察到PAL基因表達(dá)量下調(diào)和酶活性下降。Chang等[41]也有相關(guān)的報道，AtPAL2在煙草中過表達(dá)使綠原酸含量增加2倍，而在HQT沉默的AtPAL2過表達(dá)植株中綠原酸含量減少50%。

2.5 羥基肉桂酰輔酶A莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因

羥基肉桂酰輔酶A莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（hydroxycinnamoyl CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltr-ansferase，HCT）是木質(zhì)素單體生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，催化香豆酰輔酶A（p-coumaroyl CoA）發(fā)生羥基化作用轉(zhuǎn)化成咖啡酰輔酶A（caffeoyl CoA），也是控制木質(zhì)素H-單體轉(zhuǎn)化為G/S-單體的關(guān)鍵酶[42]。Hoffmann等[43]已從煙草中純化得到HCT，對其活性進(jìn)行分析表明，該酶能夠催化莽草酸或奎尼酸與香豆酸和咖啡酸生成酯，對莽草酸的親和力更高。此外，還發(fā)現(xiàn)煙草HCT能催化綠原酸水解，形成咖啡酰輔酶A和奎寧酸。

到目前為止，已經(jīng)相繼有擬南芥、煙草、番茄、桉樹、輻射松、洋姜和洋白菜等多個物種的HCT基因被克隆[38]。在朝鮮薊中，編碼HCT基因的cDNA已被分離得到[44]，同時發(fā)現(xiàn)HCT有助于綠原酸的生物合成。

HCT在植物中分布具有一定的組織特異性，在煙草中從莖、葉柄、根部、雄蕊、雌蕊、花瓣、幼葉到老葉其分布順序依次減少，而在擬南芥中，HCT在莖中分布較多，并且發(fā)現(xiàn)蛋白含量與基因表達(dá)緊密相關(guān)[42]。煙草HCT還可能參與綠原酸向咖啡酰輔酶A的再分配，因?yàn)闊煵葜仓闔CT沉默后綠原酸在莖桿中大量積累[45]。李 洋等[46]運(yùn)用高效液相色譜（HPLC）檢測轉(zhuǎn)基因煙草植株綠原酸和類黃酮物質(zhì)的含量變化，表明NtHCT基因不僅參與綠原酸合成的調(diào)控，而且正向調(diào)控類黃酮物質(zhì)的生物合成。

2.6 對-香豆酸3′-羥化酶基因

對-香豆酸3′-羥化酶（ρ-coumaroylester 3′-hydroxylases， C3H）是綠原酸合成途徑中另一類關(guān)鍵酶，研究發(fā)現(xiàn)，這類酶是由細(xì)胞色素CYP98A編碼的[47]。當(dāng)它被酯化為莽草酸或奎尼酸時可催化香豆酸的3位發(fā)生羥基化反應(yīng)。C3H基因最早在擬南芥中被克隆。目前，已從擬南芥、銀杏、毛竹、火炬松、小麥、芝麻、楊樹等多種植物中成功克隆到C3H基因[38]。Schoch等[48]采用功能基因克隆的方法從擬南芥細(xì)胞色素P450中分離到CYP98A3基因，并證明CYP98A3是C3H，它主要在植物木質(zhì)部中表達(dá)，是控制植物木質(zhì)素合成代謝中的H單體轉(zhuǎn)為G/S單體的關(guān)鍵酶。Raes等[49]從擬南芥基因組中分離到3個C3H基因，發(fā)現(xiàn)只有一個基因（C3H1）在所有組織中表達(dá)，其他2個基因僅在特定發(fā)育階段的特定組織中表達(dá)。NtC3H基因參與煙草中類黃酮和綠原酸等次生代謝物質(zhì)的合成。李 洋等[45]將NtC3H在煙草中過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草葉片中綠原酸及蘆丁含量分別提高了3.6倍和6.1倍，山奈酚蕓香苷含量提高了24.6倍。

3 展望

綠原酸具有廣泛的生理活性和藥理活性，在醫(yī)藥、食品、日用化工等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，綠原酸合成代謝已經(jīng)引起了廣大研究者的關(guān)注。特別是隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對綠原酸代謝通路的關(guān)鍵酶基因表達(dá)開展了大量的研究，并取得了巨大的進(jìn)展，但目前仍然有許多問題有待進(jìn)一步研究。盡管綠原酸生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的啟動子調(diào)節(jié)表達(dá)模式已經(jīng)在多個物種中報道，但有些啟動子的核心結(jié)構(gòu)域和功能性順式作用元件尚未得到表征，還應(yīng)進(jìn)一步研究。不同的生物體、組織、發(fā)育階段和環(huán)境因子等多種因素均可影響綠原酸含量及其同分異構(gòu)體組分比例。因此，如何通過現(xiàn)代生物技術(shù)改變關(guān)鍵因素來調(diào)控綠原酸的生物合成將成為研究熱點(diǎn)之一。催化綠原酸合成的關(guān)鍵酶大多為多基因編碼，采取多基因轉(zhuǎn)化策略是未來提高綠原酸合成和積累的重要方向。

煙草中綠原酸是最主要的多酚類物質(zhì)，與烤煙香氣質(zhì)和香氣量密切相關(guān)。目前，煙草中綠原酸合成積累研究主要側(cè)重于產(chǎn)物的積累及其影響因素研究，但對綠原酸合成代謝與積累機(jī)制缺乏深入的理解，不利于煙草香氣質(zhì)量的定向改善，已成為制約我國烤煙定向提升香氣質(zhì)量的重要“瓶頸”。因此，以煙草、番茄和馬鈴薯等近緣物種的基因組序列信息為基礎(chǔ)深入研究綠原酸合成代謝調(diào)控機(jī)制，同時利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)與代謝組學(xué)等多組學(xué)聯(lián)合的方法揭示綠原酸代謝流的分配規(guī)律以及與其他代謝途徑之間的互作機(jī)制，具有重要意義。此外，將綠原酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因在微生物中進(jìn)行異源表達(dá)，不僅可用于鑒定綠原酸生物合成關(guān)鍵酶基因的功能，而且可用于生產(chǎn)具有藥用價值的綠原酸及其衍生物，對提高煙草醫(yī)藥價值和煙草行業(yè)轉(zhuǎn)型升級都具有重要意義。

4 參考文獻(xiàn)

[1] NIGGEWEG R，MICHAEL A J，MARTIN C.Engineering plants with increased levels of the antioxidant chlorogenic acid[J].Nature biotechnol-ogy，2004，22（6）：746-754.

[2] 萬誠，劉仁祥，聶瓊，等.不同煙草品種綠原酸含量變化研究[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2016（2）：25-28.

[3] 周恒，許自成，趙會娜，等.煙草多酚類物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（5）：949-953.

[4] CL？魪 C，HILL L M，NIGGEWEG R，et al.Modulation of chlorogenic acid biosynthesis in Solanum lycopersicum；consequences for phenolic accumulation and UV-tolerance[J].Phytochemistry，2008，69（11）：2149-2156.

[5] ZUCKER M，AHRENS J F.Quantitative Assay of Chlorogenic Acid and its Pattern of Distribution within Tobacco Leaves[J].Plant physiology，1958，33（4）：246.

[6] ULBRICH B，ZENK M H.Partial purification and properties of hydroxyc-innamoyl-CoA：quinate hydroxycinnamoyl transferase from higher plants[J].Phytochemistry，1979，18（6）：929-933.

[7] VILLEGAS R J，KOJIMA M.Purification and characterization of hydroxy-cinnamoyl D-glucose.Quinate hydroxycinnamoyl transferase in the root of sweet potato，Ipomoea batatas Lam[J].Journal of Biological Chemistry，1986，261（19）：8729-8733.

[8] QAMARUDDIN JOGI.Studies on the Cell Suspension Culture and Regu-lation of Phenylpropanoid Metabolism of Flue-cured Tobacco[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2015.

[9] 彭東.光質(zhì)、光強(qiáng)對烤煙苯丙烷代謝關(guān)鍵酶及多酚產(chǎn)物的影響[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.

[10] IRISARRI P，ZHEBENTYAYEVA T，ERREA P，et al.Differential expr-ession of phenylalanine ammonia lyase（PAL）genes implies distinct roles in development of graft incompatibility symptoms in Prunus[J].Scientia Horticulturae，2016，204：16-24

[11] REICHERT A I，HE X Z，DIXON R A.Phenylalanine ammonia-lyase（PAL）from tobacco（Nicotiana tabacum）：characterization of the four tobacco PAL genes and active heterotetrameric enzymes[J].Biochemical Journal，2009，424（2）：233-242.

[12] TSAI C J，HARDING S A，TSCHAPLINSKI T J，et al.Genome-wide analysis of the structural genes regulating defense phenylpropanoid metabolism in Populus[J].New Phytologist，2006，172（1）：47-62.

[13] SHANG Q M，LI L，DONG C J.Multiple tandem duplication of the phenylalanine ammonia lyase genes in Cucumis.sativus L[J].Planta，2012，236（4）：1093-1105.

[14] CHANG A，LIM M H，LEE S W，et al.Tomato phenylalanine ammonia-lyase gene family，highly redundant but strongly underutilized[J].Journal of Biological Chemistry，2008，283（48）：33591.

[15] RAES J，ROHDE A，CHRISTENSEN J H，et al.Genome-wide characte-rization of the lignification toolbox in Arabidopsis[J].Plant Physiology，2003，133（3）：1051-1071.

[16] JING，GUANSHAN，JIANGTAO，et al.Recent Advances on Key Enzyme Genes in Metabolic Pathways Related to the Synthesis of Aroma Compounds in Tobacco[J].Agricultural Biotechnology，2014，170（5）：1-6.

[17] SYKES R W，GJERSING E L，F(xiàn)OUTZ K，et al.Down-regulation of p-coumaroyl quinate/shikimate 3′-hydroxylase（C3′H）and cinnamate 4-hydroxylase（C4H）genes in the lignin biosynthetic pathway of Eucalyptus urophylla× E.grandis leads to improved sugar release[J].Biotechnology for biofuels，2015，8（1）：1.

[18] REDDY M S S，CHEN F，SHADLE G，et al.Targeted down-regulation of cytochrome P450 enzymes for forage quality improvement in alfalfa（Medicago sativa L.）[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（46）：16573-16578.

[19] BLEE K，CHOI J W，O′CONNELL A P，et al.Antisense and sense expression of cDNA coding for CYP73A15，a class II cinnamate 4-hydroxylase，leads to a delayed and reduced production of lignin in tobacco[J].Phytochemistry，2001，57（7）：1159-1166.

[20] KUMAR R，VASHISTH D，MISRA A，et al.RNAi down-regulation of cinnamate-4-hydroxylase increases artemisinin biosynthesis in Artemisia annua[J].Scientific Reports，2016，6：26458.

[21] HUANG B，DUAN Y，YI B，et al.Characterization and expression profiling of cinnamate 4-hydroxylase gene from Salvia miltiorrhiza in rosmarinic acid biosynthesis pathway[J].Russian Journal of Plant Physiology，2008， 55（3）：390-399.

[22] 于利，張彥，陳愛國，等.煙草苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶肉桂酸-4-羥化酶，4-香豆酸-輔酶A基因的分離及表達(dá)特性分析[J].植物遺傳資源學(xué)報，2014，15（5）：1067-1073.

[23] LI Z，NAIR SK.Structural Basis for Specificity and Flexibility in a Plant 4-Coumarate：CoA Ligase[J].Structure，2015，23（11）：2032-2042.

[24] EHLTING J，B？TTNER D，WANG Q，et al.Three 4-coumarate：coenzyme A ligases in Arabidopsis thaliana represent two evolutionarily divergent classes in angiosperms[J].The plant journal，1999，19（1）：9-20.

[25] LEE D，DOUGLAS C J.Two divergent members of a tobacco 4-coumar-ate：coenzyme A ligase（4CL）gene family（cDNA structure，gene inherit-ance and expression，and properties of recombinant proteins）[J].Plant physiology，1996，112（1）：193-205.

[26] PAN X，LI H，WEI H，et al.Analysis of the spatial and temporal expres-sion pattern directed by the Populus tomentosa，4-coumarate：CoA ligase Pto4CL2，promoter in transgenic tobacco[J].Molecular Biology Reports，2013，40（3）：2309-2317.

[27] HU W J，KAWAOKA A，TSAI C J，et al.Compartmentalized Expression of two Structurally and Functionally Distinct 4-Coumarate：CoA Ligase Genes in Aspen（Populus tremuloides）[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1998，95（9）：5407-5412.

[28] HAMBERGER B，HAHLBROCK K.The 4-coumarate：CoA ligase gene family in Arabidopsis thaliana comprises one rare，sinapate-activating and three commonly occurring isoenzymes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2004，101（7）：2209-2214.

[29] SOLTANI B M，EHLTING J，HAMBERGER B，et al.Multiple cis-regu-latory elements regulate distinct and complex patterns of developmental and wound-induced expression of Arabidopsis thaliana 4CL gene family members[J].Planta，2006，224（5）：1239-1240.

[30] HU W J，KAWAOKA A，TSAI C J，et al.Compartmentalized Expression of two Structurally and Functionally Distinct 4-Coumarate：CoA Ligase Genes in Aspen（Populus tremuloides）[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1998，95（9）：5407-5412.

[31] BECKERANDR？魪 M，SCHULZELEFERT P，HAHLBROCK K.Structural comparison，modes of expression，and putative cis-acting elements of the two 4-coumarate：CoA ligase genes in potato[J].Journal of Biological Chemistry，1991，266（13）：8551.

[32] LEE D，DOUGLAS C J.Two Divergent Members of a Tobacco 4-Coumarate：Coenzyme A Ligase（4CL）Gene Family（cDNA Structure，Gene Inheritance and Expression，and Properties of Recombinant Proteins）[J].Plant Physiology，1996，112（1）：193-205.

[33] GUI J，SHEN J，LI L.Functional characterization of evolutionarily diver-gent 4-coumarate：coenzyme a ligases in rice[J].Plant Physiology，2011， 157（2）：574-586.

[34] EHLTING J，B？譈TTNER D，WANG Q，et al.Three 4-coumarate：coenzy-me A ligases in Arabidopsis thaliana，represent two evolutionarily divergent classes in angiosperms[J].Plant Journal，1999，19（1）：9-20.

[35] 趙艷玲，陸海，陶霞娟，等.GRP1.8融合反義4CL1基因調(diào)控?zé)煵菽举|(zhì)素生物合成[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，25（4）：16-20.

[36] LU H，ZENG Q，ZHAO Y L，et al.Xylem-specific expression of a GRP1.8 promoter：：4CL gene construct in transgenic tobacco[J].Plant Growth Regulation，2003，41（3）：279-286.

[37] TIAN X M，XIE J，ZHAO Y L，et al.Sense-，antisense-and RNAi-4CL1 regulate soluble phenolic acids，cell wall components and growth in transgenic Populus tomentosa Carr[J].Plant physiology and biochemistry，2013，65：111-119.

[38] 蔣向輝.金銀花CGA合成途徑關(guān)鍵酶基因克隆與功能分析[D].長沙：湖南大學(xué)，2013.

[39] LEPELLEY M，CHEMINADE G，TREMILLON N，et al.Chlorogenic acid synthesis in coffee：An analysis of CGA content and real-time RT-PCR expression of HCT，HQT，C3H1，and CCoAOMT1 genes during grain development in C.canephora[J].Plant Science，2007，172（5）：978-996.

[40] PAYYAVULA R S，SHAKYA R，SENGODA V G，et al.Synthesis and regulation of chlorogenic acid in potato：Rerouting phenylpropanoid flux in HQT-silenced lines[J].Plant biotechnology journal，2015，13（4）：551-564.

[41] CHANG J，LUO J，HE G.Regulation of polyphenols accumulation by combined overexpression/silencing key enzymes of phyenylpropanoid pathway[J].Acta biochimica et biophysica Sinica，2009，41（2）：123-130.

[42] 王雪霞，薛永常，趙文超.木質(zhì)素生物合成中C3H/HCT的研究進(jìn)展[J].生命的化學(xué)，2008，28（5）：650-653.

[43] HOFFMANN L，MAURY S，MARTZ F，et al.Purification，cloning，and properties of an acyltransferase controlling shikimate and quinate ester （下轉(zhuǎn)第10頁）

（上接第8頁）

intermediates in phenylpropanoid metabolism[J].Journal of biological chemistry，2003，278（1）：95-103.

[44] COMINO C，LANTERI S，PORTIS E，et al.Isolation and functional cha-racterization of a cDNA coding a hydroxycinnamoyltransferase involved in phenylpropanoid biosynthesis in Cynara cardunculus L[J].BMC Plant Biology，2007，7（1）：1-14.

[45] HOFFMANN L，BESSEAU S，GEOFFROY P，et al.Silencing of hydrox-ycinnamoyl-coenzyme A shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransfera-se affects phenylpropanoid biosynthesis[J].The Plant Cell，2004，16（6）：1446-1465.

[46] 李洋，李明，岳瑋，等.煙草NtHCT基因?qū)Υ紊x物質(zhì)綠原酸和類黃酮合成的影響[J].中國煙草學(xué)報，2015，21（6）：127-131.

[47] 徐曉蘭.靈芝三萜和金銀花綠原酸生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的挖掘及分析[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2013.

[48] SCHOCH G，GOEPFERT S，MORANT M，et al.CYP98A3 from Arabid-opsis thaliana is a 3′-hydroxylase of phenolic esters，a missing link in the phenylpropanoid pathway[J].Journal of Biological Chemistry，2001， 276（39）：36566-36574.

[49] RAES J，ROHDE A，CHRISTENSEN J H，et al.Genome-wide characte-rization of the lignification toolbox in Arabidopsis[J].Plant Physiology，2003，133（3）：1051-1071.