王麗君,楊熙凱,徐 冰,趙 晰,王耀光
(1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,天津 300073)
隨著糖尿病腎?。―N)的患病率越來(lái)越高,DN進(jìn)入終末期腎?。‥SRD)的人數(shù)逐漸上升,DN給個(gè)人、家庭、社會(huì)都帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)[1-2]。腎纖維化幾乎是所有慢性腎臟病進(jìn)展為ESRD的共同途徑,其中以DN腎纖維化最為顯著[3]。隨著對(duì)DN研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化在DN進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用,延緩腎小管間質(zhì)纖維化的研究對(duì)改善患者預(yù)后有重要意義[4]。目前干預(yù)DN腎纖維化主要從原發(fā)病入手,如控制血糖、調(diào)節(jié)血脂、改善腎臟血流動(dòng)力學(xué)、保護(hù)腎功能等,而抗腎纖維化方面尚缺乏靶向藥物。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)注重整體觀念,在治療上主張“分期辨治,辨證論治,綜合治療”,中醫(yī)藥干預(yù)、治療DN具有較好療效,近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始把研究方向指向中醫(yī)學(xué)。
糖腎1號(hào)方是王耀光教授治療DN的經(jīng)驗(yàn)方,在改善DN患者臨床癥狀、調(diào)節(jié)糖脂代謝、降低尿白蛋白方面具有良好的療效[5]。糖腎1號(hào)方早期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)糖腎1號(hào)方對(duì)早期DN大鼠的尿蛋白及尿微量白蛋白有明顯改善作用,可增強(qiáng)機(jī)體氧自由基的清除能力,調(diào)節(jié)血清中炎癥介質(zhì),進(jìn)而延緩腎小球硬化程度,減輕脂質(zhì)過(guò)氧化程度而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能[6]。為了進(jìn)一步探究糖腎1號(hào)方的作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)以高糖環(huán)境下誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)為研究模型,運(yùn)用蛋白免疫印跡(Western blot)法和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)方法檢測(cè)了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌蛋白(α-SMA)、纖維連接蛋白(FN),及調(diào)控基因的mRNA表達(dá)量。以期通過(guò)現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段,揭示糖腎1號(hào)方可能的作用機(jī)制。
1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)所用的HK-2細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠12只,體質(zhì)量(250±10)g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,大鼠飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所,普通飼料喂養(yǎng)。
1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 糖腎1號(hào)方:黃芪30 g,白術(shù)15 g,丹參 15 g,山藥 30 g,鬼箭羽 15 g,川芎 12 g,防風(fēng)15 g,防己 15 g,萆薢 15 g,生地 12 g,石菖蒲 15 g,地龍12 g,天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院國(guó)藥堂提供,用時(shí)旋蒸濃縮,批號(hào):2018002。
1.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 MEM ALPHA細(xì)胞培養(yǎng)基(批號(hào)C12571500BT,Gibco公司);胎牛血清(批號(hào) sv30087.03,HyClone公司);胰蛋白酶 1∶250(Genview,貨號(hào):GP3108);4-甲基偶氮唑藍(lán)(MTT,Beyotime公司),貨號(hào)/批號(hào):C0009/081817171103);TGF-β1、α-SMA、FN 抗體(Abcam 公司);葡萄糖(批號(hào)201710102,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司),配制為30 mmol/L的溶液。FORMA3111 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司);AIRTECH生物安全柜(產(chǎn)地:中國(guó));Nikon TE 300倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司);Osterode離心機(jī)(德國(guó)Thermo Fisher公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司);電泳儀(北京六一儀器廠)。
2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HK-2細(xì)胞置于MEM ALPHA培養(yǎng)基中,并加入10%青霉素及鏈霉素100 μg/mL,在 95%O2、5%CO2、37 ℃條件下傳代培養(yǎng)。
2.2 含藥血清的制備 取健康SD雄性大鼠12只,測(cè)體質(zhì)量,根據(jù)體質(zhì)量分層隨機(jī)分為空白血清組、糖腎1號(hào)方低劑量組、糖腎1號(hào)方高劑量組,每組4只,依據(jù)人臨床用藥劑量,計(jì)算出大鼠的等效劑量,本實(shí)驗(yàn)中糖腎1號(hào)低劑量組為等效劑量,高劑量組為等效劑量的5倍,低劑量組用藥劑量18 g/kg,高劑量組用藥劑量90 g/kg,灌胃給藥;空白血清組使用生理鹽水灌胃。灌胃劑量10 mL/kg,1次/日,共7 d。于第7天灌胃后30 min經(jīng)大鼠股動(dòng)脈取血10 mL,離心制備血清,56℃滅活,-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>
2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 1)空白組:MEM ALPHA培養(yǎng)基;2)高糖組:MEM ALPHA培養(yǎng)基+30 mmol/L葡萄糖;3)空白血清對(duì)照組:MEM ALPHA培養(yǎng)基+30 mmol/L葡萄糖+10%空白血清;4)糖腎1號(hào)方低劑量組:MEM ALPHA培養(yǎng)基+30 mmol/L葡萄糖+10%低劑量含藥血清;5)糖腎1號(hào)方高劑量組:MEM ALPHA培養(yǎng)基+30 mmol/L葡萄糖+10%高劑量含藥血清。
3.1 引物設(shè)計(jì) 在NCBI基因庫(kù)中查詢所需要的相關(guān)基因序列,然后通過(guò)Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件來(lái)設(shè)計(jì)引物序列,設(shè)置好后與blast網(wǎng)站中的基因序列進(jìn)行對(duì)比,最后確定目的基因的序列,具體信息見(jiàn)表1。
表1 引物序列列表Tab.1 List of primer sequences
3.2 實(shí)驗(yàn)方法 用Trizol提取腎HK-2細(xì)胞總RNA后,采用TIANScript RT KIT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到所需cDNA,選擇β-actin為內(nèi)參基因,用熒光定量PCR儀,進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增,采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析,具體實(shí)驗(yàn)步驟及添加試劑按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,所設(shè)置的反應(yīng)體系 20 μL,反應(yīng)條件為:95 ℃、15 min、1 個(gè)循環(huán),95 ℃、10 s、40 個(gè)循環(huán),58 ℃、30 s,72 ℃、30 s。
提取總蛋白后用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定各細(xì)胞樣本蛋白含量。根據(jù)蛋白定量的結(jié)果,于離心管中加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品和蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液并輕輕混勻,置于95℃加熱片中進(jìn)行蛋白變性處理10 min,然后迅速插入冰中冷卻待用;將變性后的蛋白樣品輕輕用加樣器小心加至凝膠孔中,設(shè)置電泳儀參數(shù)為穩(wěn)壓狀態(tài)并接通電源,將電壓調(diào)至80 V進(jìn)行電泳;裁剪好PVDF膜并置于100%甲醇中浸泡2~3 min使其活化,然后用水和電轉(zhuǎn)液分別漂洗2 min;同時(shí)剪裁與膠同樣大小的6層濾紙,并用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡備用。電泳結(jié)束后取下電泳板,小心剝離夾板中的墊片并去掉上層玻璃板,切除濃縮膠部分,用電轉(zhuǎn)液將含樣品膠漂洗1次;按照從黑色負(fù)極開(kāi)始依次為海綿墊片、3層濾紙、樣品膠、PVDF膜、3層濾紙、海綿墊片,排列整齊后用玻璃棒輕壓以排除多余的氣泡,固定好放入含有轉(zhuǎn)膜緩沖液的轉(zhuǎn)移電泳槽中;設(shè)置電流130 mA,電壓20 V左右,轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,逐層掀去各層,小心取出PVDF膜標(biāo)記好正反面及樣品順序后放入封閉液中,水平搖床上緩慢震蕩室溫封閉1 h;將一抗用封閉液稀釋?zhuān)粚⒎忾]后的膜直接放入一抗工作液中,置于水平搖床上緩慢振蕩室溫孵育4 h;回收一抗,用TBST洗膜3次,將洗滌后的一抗反應(yīng)膜以1∶3 000的比例放入二抗工作液中,室溫、避光放搖床上緩慢搖動(dòng)作用60 min;回收二抗,用1×TBST洗膜3次,用凝膠成像系統(tǒng)曝光及洗片,用Image J軟件分析灰度值。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用軟件SPSS 22.0進(jìn)行分析處理,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較若方差齊采用LSD法,若方差不齊采用Dunnett’s T3法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
6.1 RT-PCR檢測(cè)HK-2細(xì)胞中TGF-β1、α-SMA、FN mRNA的表達(dá)
6.1.1 TGF-β1 mRNA表達(dá) 與空白組相比,高糖組TGF-β1 mRNA表達(dá)明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與高糖組相比,空白血清組 TGF-β1 mRNA表達(dá)量較多,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高糖組相比,糖腎1號(hào)方低劑量組和糖腎1號(hào)方高劑量組TGF-β1 mRNA表達(dá)量均減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與糖腎1號(hào)方低劑量組比較,糖腎1號(hào)方高劑量組TGF-β1 mRNA表達(dá)減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。
6.1.2 α-SMA mRNA表達(dá) 與空白組相比,高糖組α-SMA mRNA表達(dá)明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與高糖組相比,空白血清組α-SMA mRNA表達(dá)增多,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高糖組相比,糖腎1號(hào)方低劑量組和糖腎1號(hào)方高劑量組α-SMA mRNA表達(dá)量均減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與糖腎1號(hào)方低劑量組相比,糖腎1號(hào)方高劑量組α-SMA mRNA表達(dá)量減少,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。
6.1.3 FN mRNA表達(dá) 與空白組相比,高糖組FN mRNA 表達(dá)增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與高糖組相比,空白血清組FNmRNA表達(dá)無(wú)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高糖組相比,糖腎1號(hào)方低劑量組和糖腎1號(hào)方高劑量組FN mRNA表達(dá)量均減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與糖腎1號(hào)方低劑量組相比,糖腎1號(hào)方高劑量組FN mRNA表達(dá)減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。
表2 RT-PCR檢測(cè)檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、FN mRNA的表達(dá)(相對(duì)β-actin的相對(duì)表達(dá)量,±s)Tab.2 RT-PCR detection of tubular epithelial cells TGF-β1,α-SMA,FN mRNA expression(relative to β-actin relative expression,±s)
表2 RT-PCR檢測(cè)檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、FN mRNA的表達(dá)(相對(duì)β-actin的相對(duì)表達(dá)量,±s)Tab.2 RT-PCR detection of tubular epithelial cells TGF-β1,α-SMA,FN mRNA expression(relative to β-actin relative expression,±s)
注:與空白組比較,*P<0.05;與高糖組比較,#P<0.05;與糖腎 1 號(hào)方低劑量組比較,△P<0.05。
組別 n TGF-β1 α-SMA FN空白組 3 1.10±0.19 1.00±0.04 1.02±0.04高糖組 3 19.19±2.87* 3.05±0.40* 5.99±0.80*空白血清組 3 17.41±1.03* 2.70±0.39* 5.98±0.54*糖腎 1 號(hào)方低劑量組 3 8.69±1.64*# 1.81±0.05*# 3.5±0.68*#糖腎 1 號(hào)方高劑量組 3 4.55±0.65*#△ 1.45±0.09# 2.0±0.44#△
6.2 WesternBlot法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞中TGF-β1、α-SMA、FN蛋白的表達(dá)
6.2.1 TGF-β1蛋白表達(dá) 與空白組相比,高糖組TGF-β1蛋白表達(dá)增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與高糖組相比,空白血清組TGF-β1蛋白表達(dá)量減少,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與高糖組相比,糖腎1號(hào)方低劑量組和糖腎1號(hào)方高劑量組TGF-β1蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與糖腎1號(hào)方低劑量組相比,糖腎1號(hào)方高劑量組TGF-β1蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3和圖1。
6.2.2 α-SMA蛋白表達(dá) 與空白組相比,高糖組α-SMA蛋白表達(dá)明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與高糖組相比,空白血清組α-SMA蛋白表達(dá)減少,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高糖組相比,糖腎1號(hào)方低劑量組α-SMA蛋白表達(dá)量減少,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與高糖組相比,糖腎1號(hào)方高劑量組α-SMA蛋白表達(dá)量減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與糖腎1號(hào)方低劑量組相比較,糖腎1號(hào)方高劑量組α-SMA蛋白表達(dá)減少,但減少的灰度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表3和圖1。
6.2.3 FN蛋白表達(dá) 與空白組相比,高糖組FN蛋白表達(dá)增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與高糖組相比,空白血清組FN蛋白表達(dá)減少,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與高糖組相比,糖腎1號(hào)方低劑量組和糖腎1號(hào)方高劑量組FN蛋白表達(dá)量減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與糖腎1號(hào)方低劑量組比較,糖腎1號(hào)方高劑量組FN蛋白表達(dá)減少,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3和圖1。
表3 Western blot法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、FN蛋白的表達(dá)(相對(duì) β-actin的灰度值,±s)Tab.3 Western blot to detect the expression of TGF-β1,α-SMA and FN in renal tubular epithelial cells(relative to the gray value of β-actin,±s)
表3 Western blot法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、FN蛋白的表達(dá)(相對(duì) β-actin的灰度值,±s)Tab.3 Western blot to detect the expression of TGF-β1,α-SMA and FN in renal tubular epithelial cells(relative to the gray value of β-actin,±s)
注:與空白組比較,*P<0.05;與高糖組比較,#P<0.05。
組別 動(dòng)物數(shù) TGF-β1 α-SMA FN空白組 3 0.28±0.03 0.32±0.14 0.31±0.06高糖組 3 0.58±0.10* 0.49±0.03* 0.63±0.20*空白血清組 3 0.56±0.11* 0.42±0.04 0.54±0.14*糖腎 1 號(hào)方低劑量組 3 0.58±0.04* 0.38±0.09 0.43±0.05*#糖腎 1 號(hào)方高劑量組 3 0.61±0.05* 0.28±0.07# 0.37±0.03#
圖1 各組TGF-β1、α-SMA、FN蛋白表達(dá)的比較Fig.1 Comparison of TGF-β1,α-SMA and FN proteinexpression in treatment groups of each group
DN是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一,早期臨床表現(xiàn)為微量白蛋白尿,病理表現(xiàn)上表現(xiàn)為腎小球肥大、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)增多、腎小球硬化和間質(zhì)纖維化[7]。本病屬于中醫(yī)“關(guān)格”、“水腫”、“腎消”、“內(nèi)消”、“下消”等范疇,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其病因主要與先天稟賦不足、后天飲食不節(jié)、平素情志失調(diào)、房勞過(guò)度、六淫邪毒等密切相關(guān),病位主要在肺脾腎三臟?;静C(jī)為本虛標(biāo)實(shí),早期多為氣陰兩傷,瘀血阻絡(luò),腎失封藏;日久脾腎俱損,陰陽(yáng)兩虛,夾有瘀血和水濕潴留,泛溢肌膚;病變晚期,腎陽(yáng)衰憊,水濕泛濫,濁毒內(nèi)停,上凌心肺。治療上,因病機(jī)多為氣陰虧虛,瘀血阻絡(luò),脾腎虧虛,故治以益氣養(yǎng)陰,活血化瘀,健脾益腎。王耀光教授總結(jié)多年治療DN的臨床經(jīng)驗(yàn),認(rèn)為DN的基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí),虛實(shí)夾雜,本虛以脾腎虧虛、氣陰兩虛為主,以血瘀、痰濁、水濕為標(biāo),故提出健脾補(bǔ)腎、益氣養(yǎng)陰、活血祛濁法為治療DN的基本原則,自擬“糖腎1號(hào)方”。其主要藥物組成為:黃芪、生地、白術(shù)、山藥、丹參、鬼箭羽、川芎、石菖蒲、防己等。方中黃芪、生地、白術(shù)、山藥益氣養(yǎng)陰,健脾補(bǔ)腎;鬼箭羽、丹參、川芎、石菖蒲、防己破血通經(jīng)、養(yǎng)血活血、祛風(fēng)通絡(luò)、化濕祛濁、利水消腫,標(biāo)本兼治,共奏益氣養(yǎng)陰、健脾補(bǔ)腎、活血化濁法。此外,繼承黃文政教授活血通絡(luò)、散結(jié)通絡(luò)思想,認(rèn)為DN腎纖維化屬于濕濁瘀毒互織之“微型癥瘕”,因此臨床上多配伍蟲(chóng)蟻搜剔之品以破血逐瘀通絡(luò),祛頑痰、破死血。瘀阻輕者可用蟬蛻、白僵蠶、地龍,稍重者可加用全蝎,瘀阻嚴(yán)重者可加用蜈蚣、烏梢蛇等[8]。
DN腎纖維化的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜,與氧化應(yīng)激、糖脂代謝紊亂、炎癥反應(yīng)等有關(guān),還涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等。目前干預(yù)DN腎纖維化主要從原發(fā)病入手,如控制血糖、調(diào)節(jié)血脂、改善腎臟血流動(dòng)力學(xué)、保護(hù)腎功能等,經(jīng)過(guò)前期臨床觀察,發(fā)現(xiàn)“糖腎1號(hào)方”可以控制血糖、調(diào)節(jié)血脂、降低24 h尿蛋白定量保護(hù)腎功能[5]。TGF-β1是目前公認(rèn)的致纖維化細(xì)胞因子,在腎纖維化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,可調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[9]。EMT是腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。α-SMA是EMT的主要標(biāo)記蛋白,是肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的標(biāo)志[10]。α-SMA表達(dá)的增多,說(shuō)明成纖維細(xì)胞被活化,分泌和增殖膠原的能力增強(qiáng),細(xì)胞外基質(zhì)形成增多,促進(jìn)纖維化的形成。因此,TGF-β1和α-SMA的表達(dá)對(duì)于EMT和ECM的進(jìn)展及預(yù)后具有重要意義[11]。FN異常增高提示細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度積聚,是糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的主要表現(xiàn)之一[12]。因此腎病纖維化的進(jìn)程可以通過(guò)TGF-β1、α-SMA、FN的表達(dá)水平來(lái)反應(yīng)。HK-2細(xì)胞自身具有非常強(qiáng)的可塑性,為適應(yīng)不同的生存環(huán)境,可針對(duì)外來(lái)不同刺激作出相應(yīng)的自身調(diào)節(jié)反應(yīng)。高糖培養(yǎng)HK-2細(xì)胞24 h時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)改變,細(xì)胞伸長(zhǎng)呈梭形,輪廓界限不清晰。高糖培養(yǎng)短時(shí)間刺激其增殖,刺激ECM的分泌,促進(jìn)表達(dá),長(zhǎng)時(shí)間刺激誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞大量凋亡,并可誘導(dǎo)小鼠腎小管上皮向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[13]。本實(shí)驗(yàn)以高糖環(huán)境下培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞為模型,經(jīng)糖腎1號(hào)方含藥血清干預(yù)后,TGF-β1、α-SMA、FN mRNA 表達(dá)水平明顯被抑制(P<0.05),相應(yīng)的 α-SMA、FN 蛋白的表達(dá)水平也出現(xiàn)了明顯的下調(diào)(P<0.05),這說(shuō)明糖腎 1號(hào)方抗腎病纖維化的作用機(jī)制可能與其能夠影響腎纖維化環(huán)路中關(guān)鍵基因及蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。在高濃度含藥血清與低濃度含藥血清的比較中發(fā)現(xiàn)不同濃度對(duì)于TGF-β1和FN mRNA的表達(dá)有明顯的差異,且高濃度含藥血清功效明顯優(yōu)于低濃度含藥血清。說(shuō)明藥量的不同,其藥物效應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生一定的變化。
綜上所述,糖腎一號(hào)方可治DN纖維化的作用機(jī)制可能為:該方可干預(yù)高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、FN mRNA 及蛋白表達(dá)水平,通過(guò)下調(diào)TGF-β1、α-SMA及FN mRNA表達(dá),進(jìn)而下調(diào)α-SMA及FN蛋白表達(dá),從而抑制腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中關(guān)鍵的EMT和ECM過(guò)度沉積過(guò)程,在一定程度上達(dá)到抑制腎間質(zhì)纖維化過(guò)程的目的。故糖腎I號(hào)方或可在DN治療中具有一定意義,有助于延緩DN進(jìn)展至ESRD的進(jìn)程。