陳正義，歐輝彬，傅昇，林松挺，鐘文州

1. ?？谑腥嗣襻t(yī)院，海南 ?？?570208；2. 竹腳婦幼醫(yī)院 兒科醫(yī)學(xué)學(xué)部，新加坡 299899，新加坡

引言

對(duì)癌癥的診斷臨床目前主要用取樣活檢，通過病理學(xué)這個(gè)“金標(biāo)準(zhǔn)”給于確診，活檢是指對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行病理組織切片檢查，有較高的準(zhǔn)確率，但缺點(diǎn)是微小病變和較深層病變很容易漏檢，為此人們一直在尋找一種能替代活檢方法，自體熒光診斷技術(shù)就是在這樣背景下產(chǎn)生，從而引發(fā)了人們對(duì)它的探索和研究[1]。激光誘導(dǎo)自體熒光（Laser-Induced Auto fl uorescence，LIAF）診斷技術(shù)是采用一定波長(zhǎng)的激光作為激發(fā)光源，激發(fā)組織產(chǎn)生自體熒光[2]，其利用正常組織與癌變組織自體熒光光譜及強(qiáng)度存在明顯差異來診斷病變，具有靈敏度高、實(shí)時(shí)、無損、準(zhǔn)確、診斷需時(shí)短等特點(diǎn)，使臨床診斷早癌普查變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)[3]。本文以海南省2017年度重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“激光誘導(dǎo)自體熒光技術(shù)研究及其診斷消化道早癌的臨床應(yīng)用”為背景，應(yīng)用LIAF診斷技術(shù)在臨床上做了在體實(shí)驗(yàn)對(duì)其理論基礎(chǔ)和應(yīng)用進(jìn)行了深入的研究與探討。

1 激光誘導(dǎo)自體熒光的原理及檢測(cè)系統(tǒng)組成

1.1 激光誘導(dǎo)自體熒光的原理

一束激光照射人體組織后，生物分子吸收了光能，該分子會(huì)從基能態(tài)躍升到高能態(tài)，處于高能態(tài)的分子極不穩(wěn)定，在一定時(shí)間內(nèi)它從高能態(tài)返回基能態(tài)，以光能形式向外釋放之前吸收的外來能量，在此過程中分子會(huì)通過自行釋放能量而產(chǎn)生熒光，此過程是通過激光誘導(dǎo)而產(chǎn)生自體熒光[4]；早期癌是指病變浸潤(rùn)不超過粘膜下層的癌，其中局限于黏膜層的稱為“黏膜內(nèi)癌”，其特點(diǎn)是癌變病灶小，厚度薄，癥狀不明顯，尤其平坦型或黏膜下病變，更不易發(fā)覺，僅憑肉眼和常規(guī)的檢測(cè)手段很難發(fā)現(xiàn)，極易漏診[5]。消化道早癌檢測(cè)系統(tǒng)就是基于人體生物分子的熒光特性來研究的，自體熒光的光譜特征與生物組織的光學(xué)特性有關(guān)[6]。由于人體不同組織的生化組成和形態(tài)結(jié)構(gòu)不同，因而不同組織具有獨(dú)特的光學(xué)特性和光譜特征，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人體組織有許多較重要的熒光物質(zhì)，如膠原蛋白（熒光峰400 nm）、黃素腺嘌呤二核苷酸（熒光峰520 nm）、彈性蛋白（熒光峰400 nm）、血卟淋衍生物（熒光峰630 nm和680 nm），正常組織和腫瘤組織由于分化不同，會(huì)有不同的生化成分，或者生化成分相似，但各成分比例卻不同[7]；因此，正常組織和腫瘤組織在受到同樣條件下激光照射時(shí)所產(chǎn)生的自體熒光光譜形狀和強(qiáng)度即波長(zhǎng)曲線不同，因而可根椐熒光光譜形狀的差異性來區(qū)分他們，相關(guān)研究表明腸癌組織，胃癌組織都具有這種特性，使用熒光光譜分析的方法能將他們與正常組織區(qū)別開來[8]。

1.2 檢測(cè)系統(tǒng)組成

檢測(cè)系統(tǒng)主要由特制光纖、激光器、光譜儀、光譜分析軟件、計(jì)算機(jī)等組成，該系統(tǒng)采用超低功率的半導(dǎo)體激光器產(chǎn)生的激光作為激光光源，光纖傳導(dǎo)激光及收集被激發(fā)的自體熒光，自體熒光由微型光譜儀負(fù)責(zé)接收處理。激光波長(zhǎng)405 nm，輸出功率為5 mW，光纖在內(nèi)窺鏡（活檢通道）的輔助下進(jìn)入人體腸道或胃內(nèi)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的在體實(shí)時(shí)檢測(cè)，熒光通過光纖傳輸?shù)焦庾V儀，由它對(duì)光信號(hào)進(jìn)行采集處理并送入計(jì)算機(jī)由專業(yè)應(yīng)用軟件對(duì)熒光譜進(jìn)行分析處理并通過顯示器顯示組織熒光光譜曲線圖，供臨床研究分析診斷[9]。檢測(cè)系統(tǒng)連接圖，見圖1。

圖1 檢測(cè)系統(tǒng)連接圖

光譜儀采用美國(guó)海洋光學(xué)QE Pro高性能光譜儀，具有的高靈敏度與寬動(dòng)態(tài)范圍的特性使其成為了同等級(jí)中性能最高的微型光譜儀；其波長(zhǎng)范圍可在185～1100 nm范圍內(nèi)配置，系統(tǒng)信噪比為1000:1，配備了18位A/D轉(zhuǎn)換器，其容納15000張光譜圖的緩沖區(qū)可以在高速采集中保證數(shù)據(jù)的完整性，同時(shí)其先進(jìn)的光學(xué)設(shè)計(jì)與熱電致冷器件可以大大提高長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)的熱穩(wěn)定性；QE Pro因而具有超高的動(dòng)態(tài)范圍，成為當(dāng)前市場(chǎng)上靈敏度最高的微型光譜儀。激光光源采用波長(zhǎng)為405 nm，輸出功率5 mW，低功率、高精度、高穩(wěn)定性的藍(lán)激光器[10]。光纖探頭由定制的七根光導(dǎo)纖維組成，中間一根為發(fā)射光纖，激光束通過它照射到待測(cè)組織，周圍六根為接收光纖，作用是收集熒光并將光信號(hào)輸入光譜儀進(jìn)行處理[11]。光纖探頭一方面將激光傳送到待檢組織表面，另一方面收集弱熒光信號(hào)并耦合至光譜儀，為了能伴隨內(nèi)窺鏡檢查時(shí)做彎曲動(dòng)作，光纖探頭前端做的較短以便光纖前端能隨內(nèi)窺鏡頭部彎曲而彎曲，同時(shí)光纖材料必須具有很好的撓度，利用石英光纖透過率高適應(yīng)長(zhǎng)距離傳輸且光信號(hào)衰減小等特征[12]；針對(duì)胃體組織檢測(cè)的要求，我們專門定制了一根2.8 m長(zhǎng)傳輸丫型光纖；光纖的一頭通過內(nèi)窺鏡活檢口接觸待檢組織，另一頭的分叉一端連接激光光源，另一端連接光譜儀。

我們?cè)谟布脚_(tái)搭建時(shí)對(duì)部件進(jìn)行優(yōu)化組合，其特點(diǎn)是在激光器金屬外殼上增加導(dǎo)熱材料和風(fēng)扇散熱，解決激光器運(yùn)行時(shí)產(chǎn)生的熱量及時(shí)散發(fā)，同時(shí)在集成封裝的外殼上增加空氣對(duì)流口；內(nèi)置專用主板主要是通過軟件達(dá)到對(duì)激光器和光譜儀等設(shè)備的控制，使用獨(dú)立電源同時(shí)供電驅(qū)動(dòng)激光器、控制主板、光譜儀。集成內(nèi)部采用短光纖在不影響信號(hào)收集時(shí)，節(jié)約了大量設(shè)備內(nèi)部空間使得集成外觀更簡(jiǎn)潔。

操作軟件采用SpecSuite光譜分析軟件可連接美國(guó)海洋光學(xué)全系列光譜儀，獲取光譜測(cè)試數(shù)椐，它是一個(gè)完全模塊化的光譜軟件平臺(tái)，運(yùn)行在Win2000，XP，Vista，Win7（32位）操作系統(tǒng)，具有采集、調(diào)度、多樣圖譜數(shù)據(jù)處理等功能，每個(gè)功能都是一個(gè)獨(dú)立的模塊，可以添加或刪除模塊為建立一個(gè)專有的用戶界面或功能，能在創(chuàng)建的模塊上進(jìn)行計(jì)算、自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)程序等[13]。

2 臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)激光誘導(dǎo)自體熒光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)試，包括波長(zhǎng)校準(zhǔn)和響應(yīng)特性校準(zhǔn)，我們把系統(tǒng)應(yīng)用于胄組織在體自體熒光光譜的檢測(cè)和分析，由于研究表明在體標(biāo)本與離體處理過標(biāo)本的自體熒光光譜存在較大的差異[14]；因此本實(shí)驗(yàn)全部為電子胃鏡檢查時(shí)進(jìn)行在體胃組織自體熒光光譜的檢測(cè)，同時(shí)對(duì)病變組織標(biāo)本取樣，所有診斷以病理診斷結(jié)果為準(zhǔn)，在相同條件下（QE Pro光譜儀使用參數(shù)為積分時(shí)間為50 ms，平均次數(shù)為10次，平滑寬度為5，波段：480～750 nm）對(duì)?？谑腥嗣襻t(yī)院消化內(nèi)鏡中心41個(gè)患者進(jìn)行連續(xù)LIAF光譜檢測(cè)和分析，其中男性26例，女性15例，年齡26～82歲依據(jù)病理診斷結(jié)果共測(cè)試了6個(gè)糜爛性胃炎，11個(gè)活動(dòng)性胃炎，3個(gè)表淺性胃炎，6個(gè)萎縮性胃炎，3個(gè)胃潰瘍，7個(gè)增生性息肉，3個(gè)鱗狀細(xì)胞癌，2個(gè)管狀腺瘤和41個(gè)正常組織；并從以上病例中選出典型的自體熒光光譜曲線圖，見圖2，以磷狀細(xì)胞癌光譜圖為中心分別與正常胃體組織，炎性組織、增生組織等進(jìn)行橫向分析比較查找出其差異性。

圖2 典型的自體熒光光譜曲線圖

分析圖2a～f以及測(cè)量獲的所有自體熒光光譜，發(fā)現(xiàn)胃體正常組織與胃炎、增生及癌變組織的自體熒光光譜發(fā)現(xiàn)有以下一些特征，不論是正常組織還是炎癥組織、腺瘤組織、增生組織和癌變組織主峰都為700 nm，有兩個(gè)左右次峰分別為670 nm和720 nm，主峰的寬度（約30 nm）明顯比次峰的寬度（約10 nm）大；胃體正常組織的光譜強(qiáng)度計(jì)數(shù)單位在1200～1800之間，同一病人正常組織的光譜主峰強(qiáng)度計(jì)數(shù)（為1800）高出鱗狀細(xì)胞癌組織對(duì)應(yīng)位置光譜強(qiáng)度（計(jì)數(shù)單位為950）近二倍，左右側(cè)次峰分別比正常組織對(duì)應(yīng)位置低400～1000計(jì)數(shù)單位，熒光強(qiáng)度減弱的原因可能是腫瘤組織粘膜層厚度增加導(dǎo)致的[15]，整個(gè)光譜呈剪刀狀；在波長(zhǎng)為500 nm時(shí)，光譜圖上下曲線強(qiáng)度差最大為8500個(gè)計(jì)數(shù)單位比炎癥、增生、腺瘤等組織有明顯差別（光譜圖上下最大強(qiáng)差：糜爛胃炎組織為1200個(gè)計(jì)數(shù)單位，慢性活動(dòng)性胃炎組織為3000個(gè)計(jì)數(shù)單位，慢性潰瘍組織為3000個(gè)計(jì)數(shù)單位，管腺瘤組織為3300個(gè)計(jì)數(shù)單位），從圖2a～f中鱗狀細(xì)胞癌組織光譜曲線上能看到480、550、580 nm左右有坡谷形成，而正常組織、炎癥組織、腺瘤組織、增生組織的光譜圖550、610 nm左右有波谷形成，位置也比較固定，研究表明這些波谷認(rèn)為是由于血紅蛋白在這些波長(zhǎng)位置的強(qiáng)吸收作用而造成的，它的吸收效應(yīng)對(duì)癌變組織的作用更大[16]；從圖2a～f中可見癌變組織光譜圖曲線從波長(zhǎng)580 nm到左次峰670 nm之間呈上升趨勢(shì)，而正常組織正好相反出現(xiàn)下降趨勢(shì)，炎癥、潰瘍、增生、腺瘤等組織與正常組織的光譜圖曲線在該波段卻呈現(xiàn)出相同下降趨勢(shì)。

3 討論

從臨床實(shí)驗(yàn)表明，LIAF光譜檢測(cè)技術(shù)可以明確區(qū)分正常組織與癌變組織，使早期診斷癌癥變?yōu)榭赡?，具有發(fā)展的應(yīng)用前景；從光譜圖可見胃炎癥組織在強(qiáng)度上比正常組織低，而息肉組織強(qiáng)度卻比正常組織高，正常組織比癌變組織光譜強(qiáng)度高了近二倍，癌組織產(chǎn)生較弱的熒光與激發(fā)光難于穿透癌組織激發(fā)到黏膜下層的熒光物質(zhì)有關(guān)[17]；由于癌變組織的血流豐富，血紅蛋白對(duì)紫外光的吸收，造成綠—黃熒光的減弱和紅色熒光的相對(duì)增強(qiáng)[18]；或許與胃組織癌變后膠原含量不同導(dǎo)致熒光減少有關(guān)，還需在今后的研究中以證實(shí)。

致謝

感謝海南省科學(xué)技術(shù)廳將“激光誘導(dǎo)自體熒光技術(shù)研究及其診斷消化道早癌的臨床應(yīng)用”為2017年海南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃立項(xiàng)，并提供經(jīng)費(fèi)支持，同時(shí)感謝消化內(nèi)鏡中心醫(yī)護(hù)人員對(duì)這一科研項(xiàng)目的支持與合作。沒有大家的共同努力，我們無法完成這一課題，也無法取得這樣的成績(jī)。