李 毅,夏振海,魏思宇,陳璟玥,陳安格,李自強,陳佳翎,余嘉瑤,王 恬,鐘 翔

(南京農業(yè)大學動物科技學院,江蘇南京 210095)

肥胖已經(jīng)成為一種常見的慢性疾病,在中國已經(jīng)上升為社會問題。2017年最新健康調查數(shù)據(jù)顯示,中國人的肥胖率已經(jīng)達到17%。不同于歐美國家,中國式肥胖主要表現(xiàn)為腹部脂肪堆積,極易引起非酒精性脂肪肝、糖代謝異常、脂代謝紊亂、高血壓、嘌呤代謝異常等疾病,嚴重影響到人們的日常生活,甚至會在表觀遺傳的作用機制下對后代產生影響。植物提取物作為一種天然、無污染的食品添加劑,在防治肥胖方面具有不良反應少、易于被大眾接受等特點。有國外研究者曾從400多種植物中篩選出了44種能夠抑制脂肪細胞脂質積累的粗提取物,其中葛根草、覆盆子、山茱萸提取物和尼泊爾老鸛草4種提取物具有顯著活性,表現(xiàn)出高的脂肪抑制性,對肥胖具有高的治療意義[1]。國內研究者也發(fā)現(xiàn)蕎麥、余甘子等植物提取物在防治非酒精性脂肪肝、調控脂代謝方面具有積極的效果[2-3]。

白藜蘆醇(Resveratrol)是一種主要存在于虎杖、葡萄、藜蘆、花生等植物中的多酚類化合物。相關研究表明,白藜蘆醇具有抗氧化、抗炎癥、抗心血管疾病、抗腫瘤和調節(jié)免疫等一系列功效[4-5]。Baur等[6]研究表明,口服白藜蘆醇可以安全地減少小鼠過量熱量攝入導致的許多負面后果，如線粒體數(shù)量減少，并且能夠調節(jié)已知的長壽途徑，總體上改善健康和生存。Jeon等[7]研究表明,白藜蘆醇能夠起到緩解與肥胖有關的外周和中樞炎癥和代謝紊亂,并且改善高脂日糧(HFD)喂養(yǎng)的糖尿病小鼠記憶缺陷的功能。宋昱等[8]研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇對長期高脂日糧抑制的FoxO3a、catalase和MnSOD基因通路起到了積極的作用,從而改善高脂日糧誘導的氧化還原失衡。目前,對于白藜蘆醇防治肥胖的研究主要集中在脂代謝方面,有關糖代謝和能量代謝的研究較少。本文通過探究白藜蘆醇對高脂日糧誘導的肥胖小鼠生長性能、肝臟的脂質代謝、糖代謝和能量代謝等代謝指標及相關基因的表達,以期為與白藜蘆醇的有關保健產品與食品的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所有日糧 南通特洛菲飼料科技有限公司,日糧配比參考AIN93標準[9]。LFD組飼喂TP 2330055MC飼料,原料包括酪蛋白、淀粉、糊精、蔗糖、豆油、礦物質混合物、維生素混合物、胱氨酸、膽堿、TBHQ(抗氧化劑)。低脂日糧,脂肪含量為10%;HFD組飼喂TP 2330055M飼料,原料包括酪蛋白、淀粉、蔗糖、豬油、礦物質混合物、維生素混合物、胱氨酸、膽堿、TBHQ。高脂日糧,脂肪含量為60%。

Bio-Gen Series PRO 200勻漿機 美國PRO Scientific公司;5804R型臺式高速冷凍離心機 德國 Eppendorf公司;Thermo Nano Drop 2000 超微量可見光分光光度、QuantStudio 5 Real-Time PCR 儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試驗動物分組 40只健康的C57BL/6J雄性小鼠,預實驗3周,按照體重隨機分成4組,每組10只,分別為低脂日糧組(LFD)、低脂日糧+276 mg/kg白藜蘆醇組(LR)、高脂日糧組(HFD)、高脂日糧+400 mg/kg白藜蘆醇組(HR)[8，10]。低脂飼料熱量:3.6 kcal/g,其中,脂肪熱量10%,蛋白質熱量14%,碳水化合物熱量76%。高脂飼料熱量:5.2 kcal/g,其中,脂肪熱量60%,蛋白質熱量14%,碳水化合物熱量26%。即HR組白藜蘆醇的添加量為0.04%條件下,LR組白藜蘆醇的添加量為0.0276%,此時相同采食熱量情況下,LR和HR組小鼠白藜蘆醇含量相同。

1.2.2 飼養(yǎng)管理 所有小鼠于環(huán)境衛(wèi)生良好的鼠房中同室分籠飼養(yǎng),預飼養(yǎng)3周,正式試驗為12周,小鼠自由采食和飲水,打耳標作標記。每天12 h/12 h光暗周期,室內溫度維持在(23±2) ℃,濕度50%～60%。每2 d更換一次飼料,記錄相應采食量,每周稱重一次。

1.2.3 樣品的采集 飼喂12周后,小鼠空腹24 h,稱重,乙醚麻醉,摘眼球取血0.5～1 mL,頸椎脫臼處理小鼠,迅速取出肝臟置于預冷的生理鹽水中漂洗,濾紙擦干后置于液氮中,然后放置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2.4 生長性能指標的測定 試驗期間,每周稱重,精確到0.01 g;每2 d更換飼料,記錄采食量,計算日均采食量。

1.2.5 血清指標的測定 眼球取血置于1.5 mL無菌試管中,室溫靜置15 min,在4 ℃,3500 r/min條件下離心10 min,取上清,測定AST和ALT的活力,測定步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.6 肝臟中相關代謝指標的測定 于-80 ℃冰箱取出200 mg肝臟組織,按照質量(g)∶體積(mL)為1∶9的比例,在冰浴條件下使用相應的勻漿介質進行機械勻漿,于4 ℃、3500 r/min條件下離心10 min,取上清待測。在高脂模型條件下,采用無水乙醇為勻漿介質測定LPO和MDA,采用生理鹽水為勻漿介質測定AST、ALT、Cu/Zu-SOD、HK、PK、SDH和MDH的酶活力,測定步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

需求情況：氮肥方面，尿素處于農業(yè)需求淡季，各地基本無農作物用肥需求；工業(yè)需求方面，膠板廠受大氣污染治理影響，開工率無上升，復合肥企業(yè)開工率下滑，對尿素的采購需求減少。磷肥方面，國內冬儲市場逐步展開，西北、東北市場到貨量少，華北市場交投清淡；出口市場已接近收尾，部分企業(yè)仍有出口訂單待發(fā)。鉀肥方面，復合肥企業(yè)開工率下降，對鉀肥的采購需求減少。復合肥方面，南方經(jīng)濟作物用肥需求減少，北方地區(qū)農業(yè)需求結束，冬儲備肥預收為主，鋪貨不順暢。

1.2.7 肝臟RNA的提取和mRNA表達量的測定 于-80 ℃冰箱取出100～200 mg凍存的肝臟樣品,加入1 mL預冷的Trizol溶液,用美國MP FastPrep-24勻漿機勻漿,冰上靜置5 min,加入200 μL氯仿振蕩混勻后,置于冰上靜置3 min,4 ℃、12000 g/min條件下離心15 min,取上清置于新的滅菌管中,并加入等體積的異丙醇沉淀核酸,-20 ℃靜置30 min后,4 ℃、12000 g/min條件下離心10 min,棄上清,底部白色沉淀即是RNA,用75%的酒精洗滌沉淀2～3次,超凈臺晾干,加適量的無RNA酶的水溶解沉淀。采用Thermo Nano Drop 2000超微量可見光分光光度計測定RNA的濃度和純度,10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。用無RNA酶的水稀釋到1000 ng/μL,采用TaKaRa反轉錄試劑盒進行反轉錄,所得20 μL的cDNA樣品保存于-20 ℃待測。

mRNA表達量按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix定量說明書進行測定。20 μL反應體系如下:2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上游引物(10 μmol/L)0.4 μL,下游引物(10 μmol/L)0.4 μL,cDNA x μL,加ddH2O補充到20 μL。試驗按照以下條件進行qPCR反應:預變性:95 ℃,30 s;40個循環(huán)反應:95 ℃,10 s;65 ℃,30 s;溶解曲線:95 ℃,15 s;60 ℃,60 s;95 ℃,15 s。試驗結果以2-ΔΔCt來表示,內參基因為GAPDH。

本試驗所用基因引物均由上海生工生物工程有限公司提供,引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequence

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行分析,首先采用一般線性模型(General liner model,GLM)進行主效應(日糧和白藜蘆醇)及互作效應的差異顯著性檢驗。采用單因素方差分析,Duncan’s進行多重比較,結果用平均值±標準差表示,p<0.01表示差異極顯著,p<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇對高脂誘導肥胖小鼠生長性能的影響

由表2可知,試驗期間各試驗組小鼠的體重均逐步增長。試驗12周HFD小鼠的體重比LFD小鼠提高了28.24%(p<0.05),建模成功。與LFD小鼠相比,HFD小鼠平均體重在第4周、第8周和第12周分別顯著增加了9.58%、16.94%、28.24%(p<0.05),說明在高脂日糧的條件下,HFD小鼠的體重遠超于LFD小鼠,并與時間成正相關。與HFD小鼠相比,HR小鼠體重在試驗8周和12周時分別降低了6.95%和10.71%(p<0.05),說明添加白藜蘆醇能有效的緩解體重的增加。

表2 白藜蘆醇對高脂誘導肥胖小鼠體重的影響(g)Table 2 Effect of resveratrol on weight of mice fed with high fat diet(g)

由表3可知,與LFD小鼠相比,HFD小鼠日均采食量在試驗前4周和4～8周分別顯著降低15.57%、9.48%(p<0.05),說明高脂日糧中能量較高,適口性低,小鼠采食量減少。在日糧中添加了白藜蘆醇,與HFD小鼠相比,HR小鼠的日均采食量在試驗前4周和4～8周分別顯著提高了6.13%、19.10%(p<0.05);與LFD小鼠相比,LR小鼠的日均采食量在試驗前4周、4～8周和后4周分別顯著提高了24.04%、36.00%、29.66%(p<0.05),說明在高脂日糧和低脂日糧條件下,白藜蘆醇均有提高適口性的作用。

表3 白藜蘆醇對高脂誘導肥胖小鼠日均采食量的影響(g/d)Table 3 Effect of resveratrol on average daily feed intake of mice fed with high fat diet(g/d)

本研究發(fā)現(xiàn),由于受到高脂日糧的影響,小鼠的體重顯著增加(p<0.05),與時間成正相關,但相應的小鼠的采食量顯著減少(p<0.05),可能由于高脂飼料脂肪含量太高,過于油膩,影響適口性。在高脂日糧中添加了白藜蘆醇以后,小鼠的體重顯著下降(p<0.05),采食量有所增加,但不顯著(p>0.05)。宋昱等[8]研究表明,分別飼喂C57BL/6J雄性小鼠白藜蘆醇添加量為0.04%和0.08%的高脂日糧12周,小鼠的體重顯著下降,采食量無顯著變化,其中添加0.04%的白藜蘆醇的作用效果優(yōu)于0.08%,與本試驗研究結果一致。Ku等[11]研究表明,給SD大鼠每天灌胃10 mg/kg·BW 5周,大鼠的體重明顯減輕。本試驗研究還發(fā)現(xiàn)在低脂條件下,白藜蘆醇的飼喂能夠顯著提高采食量(p<0.05),提示白藜蘆醇可能有提高適口性的作用。

2.2 白藜蘆醇對高脂誘導肥胖小鼠相關代謝的影響

2.2.1 白藜蘆醇對高脂誘導肥胖小鼠血清和肝臟中AST、ALT活力的影響 由表4可知,與LFD組小鼠相比,HFD組小鼠血清中AST和ALT活力分別顯著提高了57.51%和201.63%(p<0.05),肝臟中AST和ALT活力分別顯著降低了24.50%和19.21%(p<0.05),說明肥胖對肝臟造成了損傷,導致血清中AST和ALT升高。與HFD組小鼠相比,HR組小鼠血清中AST和ALT活力分別顯著降低了16.06%和62.87%(p<0.05);HR組小鼠肝臟中AST和ALT活力分別顯著升高了31.70%和12.81%(p<0.05),說明白藜蘆醇對肥胖引起的肝臟損傷起到緩解作用。

表4 白藜蘆醇對高脂誘導肥胖小鼠血清和肝臟AST、ALT活力的影響Table 4 Effect of resveratrol on the activities of aspartateaminotransferase(AST)and alaninetransaminase(ALT) in the serum and liver of mice fed with high fat diet

AST和ALT是衡量機體肝臟損傷的重要指標。本研究發(fā)現(xiàn),由于受到高脂日糧的影響,小鼠的血清中AST和ALT活力顯著提高(p<0.05),肝臟中AST和ALT活力有所下降,說明肥胖可能造成機體肝臟損傷。高脂日糧中添加了白藜蘆醇以后,小鼠的血清中AST、ALT均顯著減少(p<0.05),肝臟中AST、ALT均有所升高,提示白藜蘆醇可以緩解肥胖造成的肝臟損傷。段勝紅等[12]研究表明,通過每天灌胃100、50、25 mg/kg三個劑量的白藜蘆醇,高脂模型SD大鼠血清中的AST和ALT都顯著減少(p<0.05),與本試驗研究結果一致。Hussein等[13]的研究同樣發(fā)現(xiàn),飼喂白藜蘆醇能夠有效緩解雌性老鼠的肝臟損傷,降低血清中AST和ALT。

2.2.2 白藜蘆醇對高脂誘導肥胖小鼠肝臟中LPO、MDA、Cu/Zn-SOD的影響 由表5可知,與LFD組小鼠相比,HFD組小鼠肝臟中LPO和MDA含量分別升高了36.82%和76.25%(p<0.05)。與HFD組小鼠相比,HR組小鼠肝臟中LPO和MDA含量分別顯著降低了15.72%和26.95%(p<0.05),以上結果說明,白藜蘆醇對肥胖小鼠肝臟脂質過氧化反應起了正調控的作用。

表5 白藜蘆醇對高脂誘導肥胖小鼠肝臟中LPO、MDA、Cu/Zn-SOD的影響Table 5 Effect of resveratrol on the activities of lipid peroxidation assay,MDA and Cu/Zn superoxide dismutase in the liver of mice fed with high fat diet

2.2.3 白藜蘆醇對高脂誘導肥胖小鼠肝臟糖代謝及能量代謝關鍵酶及相關基因表達量的影響 由表6可知,與LFD組小鼠相比,HFD組小鼠肝臟中HK、PK、SDH和MDH活力分別降低了15.23%、37.73%、27.28%和16.38%(p<0.05)。在日糧中添加了白藜蘆醇,與HFD組小鼠相比,HR組小鼠肝臟中HK、PK、SDH和MDH活力分別升高了34.56%、85.98%、16.04%和18.70%(p<0.05)。以上結果說明,高脂日糧模型會導致小鼠肝臟糖酵解速度減慢,三羧酸循環(huán)減弱,白藜蘆醇的添加能激活相關酶活性。

表6 白藜蘆醇對高脂誘導肥胖小鼠肝臟糖代謝及能量代謝關鍵酶的影響Table 6 Effect of resveratrol on the glucose metabolism and key enzymes of energy metabolism in the liver of mice fed with high fat diet

由表7可知,與LFD組小鼠相比,HFD組小鼠肝臟中MDH1、Sdha和PGC-1αmRNA相對表達量分別顯著降低了15.90%、32.00%和28.2%(p<0.05);在日糧中添加了白藜蘆醇,與HFD組小鼠相比,HR組小鼠肝臟中Hk2、Pkm、Cs、MDH1和SdhamRNA相對表達量分別顯著升高了94.13%、34.70%、17.99%、41.26%和50.59%(p<0.05),以上結果說明白藜蘆醇對肥胖小鼠肝臟糖代謝和能量代謝相關基因表達量影響明顯,起了積極作用。

表7 白藜蘆醇對高脂誘導肥胖小鼠肝臟代謝相關基因表達量的影響Table 7 Effect of resveratrol on the metabolic related gene expression in the liver of mice fed with high fat diet

肥胖不僅會導致脂代謝紊亂,還會引起糖代謝異常等慢性疾病。HK和PK是糖酵解途徑的關鍵酶,MDH、SDH和CS是三羧酸循環(huán)途徑的關鍵酶。在饑餓的條件下,體內HK活性升高,催化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖在一系列催化作用下生成磷酸烯醇式丙酮酸,在PK的催化作用下生成丙酮酸,從而參與三羧酸循環(huán)[16-17]。本實驗研究發(fā)現(xiàn),高脂日糧造成小鼠肝臟的HK和PK活性減弱,與Hk2、Pkm mRNA表達量的變化趨勢一致,但都差異不顯著(p>0.05)。高脂日糧中添加了白藜蘆醇以后,小鼠肝臟的HK和PK活性均顯著的升高(p<0.05),對應Hk2和Pkm mRNA表達量也顯著升高(p<0.05),提示白藜蘆醇能夠緩解肥胖對糖酵解途徑的抑制作用,通過增加脂肪酸的β氧化途徑,減少脂肪的生成,從而提高糖酵解作用。Cui等[18]研究表明,飼喂高脂日糧的C57BL/6J小鼠的PGC-1α和Hk2 mRNA表達量著低于低脂日糧組,飼喂木蘭提取物BL153這種植物提取物能提高Hk2 mRNA表達量,緩解肥胖造成的腎臟損傷,與本研究結果相似,說明Hk2受到肥胖的影響表達量降低,而植物提取物對其有積極的作用。Wu等[19]研究表明,敲除Hk2,心肝中的活性氧水平顯著提高(p<0.05),揭示了能夠通過調節(jié)線粒體的通透性來減少活性氧的產生,從而緩解心肌肥大,說明Hk2與線粒體代謝有關。本研究通過白藜蘆醇調控高脂小鼠Hk2表達量,影響線粒體循環(huán)。

SDH是三羧酸循環(huán)中第一個脫氫酶,催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸,其活力大小直接反映線粒體三羧酸循環(huán)的強弱[20]。MDH存在于線粒體基質中,是三羧酸循環(huán)中重要的氧化還原酶,可將草酰乙酸還原成蘋果酸,也能催化蘋果酸轉化為草酰乙酸或者生成丙酮酸,為機體脂肪合成提供了重要的輔酶NADPH[21]。檸檬酸合成酶(citroyl synthetase,CS)催化三羧酸循環(huán)中乙酰輔酶A和草酰乙酸縮合成檸檬酸,是調控機體三羧酸循環(huán)的又一重要酶[22]。本試驗研究發(fā)現(xiàn),由于受到高脂日糧的影響,小鼠肝臟的SDH和MDH活性減弱,MDH1、Sdha和PGC-1αmRNA表達量也顯著降低(p<0.05)。高脂日糧中添加了白藜蘆醇以后,小鼠肝臟的SDH和MDH活性升高,Cs、MDH1和SdhamRNA表達量也顯著升高(p<0.05),提示白藜蘆醇能夠提高線粒體三羧酸循環(huán)活性,緩解肥胖的線粒體損傷。Desquiret-Dumas V 等[23]研究表明,白藜蘆醇能夠激活肝細胞中線粒體NADH脫氫酶活性,提高NAD/NADH比率,起到調節(jié)能量代謝的作用。Ma等[24]研究表明,白藜蘆醇能夠通過下調HIF-1α的表達,減少線粒體活性氧的產生,從而緩解機體非酒精性脂肪肝,Fang等[25]研究表明,白藜蘆醇能夠作為SIRT1的激動劑,通過提高SIRT1的活性,增加PGC-1α的去乙酰化來提高線粒體功能,從而改善糖尿病高糖引起的心肌氧化應激,線粒體功能障礙和心肌纖維化。上述研究與本文研究類似,提示白藜蘆醇能夠通過提高線粒體相關代謝酶活性、調控膜通透性減少活性氧產生等途徑來調控肥胖小鼠肝臟損傷。

3 結論

本研究結果表明,高脂日糧模型提高了血清中AST、ALT,增加了肝臟中LPO、MDA的含量,減少了肝臟中SOD、HK、PK、SDH和MDH的活力,相應的mRNA表達量也發(fā)生了一致的變化,對機體造成了損傷,引發(fā)代謝紊亂。添加了0.04%的白藜蘆醇后,相對應的指標均得到了一定程度的改善。以上結果表明:白藜蘆醇作為食品添加劑,能夠緩解高脂日糧造成的脂質代謝損傷、糖酵解損傷及三羧酸循環(huán)損傷。本研究進一步豐富了白藜蘆醇調控機體代謝方面的積極作用,也為調控機體飲食肥胖提供了新的思路和實驗依據(jù)。