方佩佩,趙麗青,馬 云,王昌軍,唐 靜,李正義,賈俊濤,姜英輝

(山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,山東青島 266002)

副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus,VP)是一種嗜鹽的革蘭氏陰性致病菌,是我國沿海地區(qū)引起食物中毒最常見的病原菌[1-2]。當(dāng)食品中副溶血性弧菌達(dá)到106CFU/mL時,即能引起食物中毒,其潛伏期為2～26 h,主要癥狀有腹痛、腹瀉、嘔吐和發(fā)燒等,嚴(yán)重可能危及生命[3-4]。副溶血性弧菌具有多種表型、血清型和產(chǎn)毒型菌株,針對溶血素設(shè)計(jì)的探針、引物不能檢測所有致病菌株[4-7]。不耐熱溶血毒素(Thermolabilehemolysin,TLH)由H. Taniguchi[8]等發(fā)現(xiàn),它不是一個毒素基因,但存在于所有副溶血性弧菌的臨床分離株和環(huán)境分離株中[6],因此本研究選取TLH基因作為靶基因進(jìn)行檢測。

近些年對副溶血性弧菌的定量檢測越來越受到關(guān)注和重視,常用的檢測副溶血性弧菌的方法有常規(guī)培養(yǎng)法、分子檢測法和免疫檢測法等,這些方法存在檢測周期長、特異性低、不能準(zhǔn)確定量等缺點(diǎn)。國標(biāo)規(guī)定,自2014年7月起水產(chǎn)制品中副溶血性弧菌的檢測為MPN定量法[9],檢測周期為3～5 d,此法敏感性及特異性差,且耗時長[1]。免疫磁分離和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測[2]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)[10-11]、實(shí)時熒光PCR技術(shù)[12-16]、多重PCR技術(shù)等,這些技術(shù)已發(fā)展較為成熟,且操作簡便、檢測周期短,但是免疫磁珠法靈敏度及特異性較低,分子檢測法不能對副溶血性弧菌進(jìn)行準(zhǔn)確定量[2]。

微滴式數(shù)字PCR技術(shù)(Droplet digital PCR,ddPCR)是近年來發(fā)展起來的快速、精確、可實(shí)現(xiàn)DNA絕對定量的PCR方法[17-18]。其原理是利用微滴生成器將含有核酸分子的反應(yīng)體系分散成2萬個獨(dú)立的納升級微滴,并進(jìn)行擴(kuò)增,最終根據(jù)陽性微滴比例及泊松分布原理，計(jì)算待測目標(biāo)拷貝數(shù)。微滴式數(shù)字PCR技術(shù)從核酸提取至完成檢測，最快能在2～3 h內(nèi)完成,它既解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)法周期長的缺點(diǎn),又能夠?qū)z測目標(biāo)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。目前,ddPCR技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌、陰溝腸桿菌、單核增生細(xì)胞李斯特氏菌[17，19-23]等食源性致病微生物檢測中,但在副溶血性弧菌的定量檢測中研究較少,針對現(xiàn)有檢測方法的不足,本研究擬采用ddPCR技術(shù)建立起副溶血性弧菌的快速準(zhǔn)確定量方法,提高檢出率及精確度,滿足公共衛(wèi)生事件快速應(yīng)急處理的需要。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)菌株及材料等詳見表1。

表1 試驗(yàn)菌株及材料Table 1 Test strains and materials

QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng) 美國伯樂公司;羅氏480實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng) 羅氏公司;CF16RXII高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司;U-3010紫外-可見分光光度計(jì) 日本日立公司;DYY-8C型電泳儀及凝膠成像分析系統(tǒng) 北京市六一儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)探針 采用V.parahaemolyticus較常用的不耐熱溶血毒素基因TLH基因引物和探針[24]見表2。

表2 副溶血性弧菌特異性PCR擴(kuò)增引物和探針序列Table 2 Primer and probe sequence for V. parahaemolyticusby polymerase chain reaction(PCR)

1.2.2 菌株活化 菌株取自-80 ℃冰箱,TSA-YE培養(yǎng)基37 ℃活化24 h,挑取單菌落在TSA-YE培養(yǎng)基上37 ℃過夜純培養(yǎng)。挑取純培養(yǎng)后的菌到10 mL的營養(yǎng)肉湯中,120 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

1.2.3 菌懸液濃度的測定及DNA提取 取活化的ATCC 17802副溶血性弧菌菌懸液,生理鹽水梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,標(biāo)記備用。用3M細(xì)菌總數(shù)測試紙片計(jì)數(shù)不同梯度菌懸液濃度,每個梯度3個平行。同時取各梯度菌液各3 mL,采用北京Tiangen提取試劑盒提取基因組DNA備用。本文中除特異性驗(yàn)證外,皆采用ATCC 17802副溶血性弧菌進(jìn)行試驗(yàn)。

采用北京Tiangen提取試劑盒，提取表1中剩余16株細(xì)菌DNA,分別標(biāo)記備用。

1.2.4 數(shù)字PCR試驗(yàn) 反應(yīng)體系:12.5 μL ddPCRTMSuperMix for Probes(no dUTP),上、下游引物各1 μL(終濃度10 pmol),探針0.5 μL(終濃度5 pmol)[25],DNA模板(60 μg/mL)2.5 μL,用雙蒸水補(bǔ)足總體積25 μL。分裝預(yù)混液各20 μL,至對應(yīng)的微滴生成卡的sample孔位里,在微滴生成卡的oil孔位分別加入70 μL的Droplet generator oil,進(jìn)行微滴生成。將生成的40 μL微滴全部轉(zhuǎn)入96孔反應(yīng)板,PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火1 min,40個循環(huán);98 ℃固化微滴10 min。最后用微滴分析儀對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

1.2.5 數(shù)字PCR方法特異性驗(yàn)證 將1.2.3中提取的17株菌DNA進(jìn)行104倍稀釋,按照1.2.4條件進(jìn)行ddPCR檢測,驗(yàn)證引物、探針特異性。

1.2.6 實(shí)時熒光PCR試驗(yàn) 參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 1870-2016 出口食品中食源性致病菌檢測方法 實(shí)時熒光PCR法》[26]。

1.2.7 數(shù)字PCR方法的檢出限及靈敏度、COPY數(shù)和菌液濃度的線性關(guān)系 將提取得到的ATCC 17802副溶血性弧菌DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(TAE配制0.8%瓊脂糖凝膠,使用GelRed核酸染料,樣品進(jìn)樣量為3 uL,電壓130 V,電泳40 min,λ DNA/Hind Ⅲ Marker,6×DNA Loading Buffer),確定DNA片段的完整性。將1.2.3提取的不同梯度副溶血性弧菌DNA,按照1.2.4和1.2.6所述方法分別進(jìn)行數(shù)字PCR和熒光定量PCR,每個梯度重復(fù)3次。確定PCR檢測副溶血性弧菌的檢出限及檢測靈敏度,建立ddPCR的Copy數(shù)和菌液濃度的線性關(guān)系。

ddPCR的Copy數(shù)與對應(yīng)菌懸液濃度的換算關(guān)系公式如下:

(1)

式中:C-根據(jù)ddPCR的Copy數(shù)換算得到菌懸液的濃度(CFU/mL);X-ddPCR中20 μL體系的Copy數(shù)(個/20μL);V1-DNA提取最終的定容體積(μL);V2-DNA提取的菌懸液體積(mL);V3-ddPCR反應(yīng)體系中DNA模板體積(μL)。

本試驗(yàn)中,DNA提取最終的定容體積V1為150 μL,DNA提取的菌懸液體積V2為3 mL,ddPCR反應(yīng)體系中DNA模板體積V3為2 μL。

1.2.8 人工污染樣品檢測 無菌混勻的鱈魚肉稱取25份,每份25 g,放于無菌均質(zhì)袋中,加入225 mL的BPW徹底混勻。采用人工污染的方式制備樣品,特異性驗(yàn)證添加表1中的17株菌,定量檢測ATCC 17802副溶血性弧菌樣品的污染水平大約在100、101、102、103、104、105、106、107CFU/g,并進(jìn)行陰性、陽性對照,按照1.2.2提取DNA,進(jìn)行ddPCR檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個試驗(yàn)重復(fù)3次,應(yīng)用SPSS對數(shù)據(jù)做顯著性及相關(guān)性分析,顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)字PCR方法特異性驗(yàn)證結(jié)果

提取表1中所列菌株的DNA,用1.2.1中副溶血性弧菌引物探針進(jìn)行ddPCR擴(kuò)增,ddPCR結(jié)果如圖1所示,三株副溶血性弧菌呈陽性微滴信號,而其他菌株及陰性對照均未出現(xiàn)擴(kuò)增,表明1.2.1中副溶血性弧菌引物探針的特異性較強(qiáng)。

圖1 數(shù)字PCR方法特異性驗(yàn)證結(jié)果圖Fig.1 Specific verification results diagram of ddPCR

2.2 PCR方法的檢出限及靈敏度結(jié)果

副溶血性弧菌DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示,兩組副溶血性弧菌條帶單一,DNA鏈完整,在提取過程中未出現(xiàn)斷裂,每個菌對應(yīng)一個模板和一個copy,因此通過ddPCR擴(kuò)增能夠較準(zhǔn)確計(jì)算菌濃度。

圖2 副溶血性弧菌瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis diagram of Vibrio parahemolyticus注:1和4為marker,2和3為副溶血性弧菌DNA。

副溶血性弧菌的各梯度菌懸液濃度如表3所示,其中原倍濃度為4.4×107CFU/mL。各梯度副溶血性弧菌DNA模板ddPCR檢測結(jié)果如圖3所示,對應(yīng)的有效菌懸液濃度即檢出限為4.7×105～4.7×101CFU/mL,各梯度換算濃度C(根據(jù)ddPCR的Copy數(shù)換算得到菌懸液的濃度)與3M測試片所得菌懸液濃度之間無顯著性差異(p>0.05)。反應(yīng)1、2中由于模板濃度過高,無陰性微滴,無法正常推測菌懸液濃度,數(shù)值無效,此情況如需確定濃度可通過稀釋菌懸液解決。本方法中,ddPCR能夠檢測到副溶血性弧菌最低檢出限為菌懸液濃度4.7×101CFU/mL,對應(yīng)ddPCR拷貝數(shù)為2 copies/20 μL,推測得模板的拷貝數(shù)為5.0×101copies/mL,靈敏度為0.2 copies/20 μL,與菌懸液濃度不具有顯著性差異(p>0.05)。

表3 檢出限及靈敏度結(jié)果Table 3 Sensitivity results

圖3 ddPCR靈敏度結(jié)果圖Fig.3 Sensitivity diagram of ddPCR注:1～8分別代表菌懸液濃度為4.4×107、4.4×106、4.4×105、 4.4×104、4.4×103、4.4×102、4.4×101、4.4×100 CFU/mL。

各梯度副溶血性弧菌DNA模板熒光PCR檢測結(jié)果如圖4及表3所示。當(dāng)濃度≥4.7×104CFU/mL時,對應(yīng)CT值≤35,檢測結(jié)果為陽性;當(dāng)濃度為4.7×103、4.7×102CFU/mL時,35

圖4 熒光定量PCR靈敏度結(jié)果圖Fig.4 Sensitivity map of qPCR注:1～8分別代表菌懸液濃度為4.4×107、4.4×106、4.4×105、 4.4×104、4.4×103、4.4×102、4.4×101、4.4×100 CFU/mL。

以副溶血性弧菌菌懸液濃度為橫坐標(biāo),以濃度C(根據(jù)ddPCR的Copy數(shù)換算得到菌懸液的濃度)為縱坐標(biāo),生成標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,R2≥0.99,說明采用ddPCR技術(shù)進(jìn)行副溶血性弧菌的定量有可行性,為進(jìn)一步的實(shí)際應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

圖5 ddPCR拷貝數(shù)與菌懸液濃度的線性關(guān)系Fig.5 Standard curve for copies of ddPCR and suspension concentration of Vibrio parahaemolyticus

2.3 人工污染樣品檢測

鱈魚樣品中分別添加3株副溶血性弧菌及14株其他菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證,結(jié)果如圖6所示,3株陽性菌出現(xiàn)明顯擴(kuò)增,陰性菌株無擴(kuò)增,結(jié)果與2.1相一致,證明TLH基因引物探針特異性較強(qiáng)。鱈魚樣品中添加梯度濃度副溶血性弧菌,提取DNA進(jìn)行ddPCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖7所示,與2.2直接提取菌懸液DNA進(jìn)行ddPCR擴(kuò)增的結(jié)果相吻合,說明采用ddPCR技術(shù)對副溶血性弧菌進(jìn)行定量實(shí)際檢測具有可行性。

圖6 人工污染樣品特異性驗(yàn)證結(jié)果圖Fig.6 Specific verification results diagram of artificially contaminated sample

圖7 梯度濃度人工污染樣品檢測結(jié)果圖Fig.7 Detection results diagram of gradient concentration artificially contaminated sample

3 結(jié)論與討論

按照副溶血性弧菌的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測要求GB 4789.7-2013[27],經(jīng)過前增菌、分離純化、生化鑒定和血清學(xué)鑒定,檢測周期為3～5 d,從提取DNA到ddPCR技術(shù)僅需幾個小時,成倍縮短周期,提高了檢測效率。

ddPCR分析濃度結(jié)果與3M測試片相比,ddPCR檢測結(jié)果偏高于3M紙片結(jié)果,這可能是由于，PCR技術(shù)主要針對生物因子核酸片段檢測,已經(jīng)死亡的或亞死亡的副溶血性弧菌DNA可能存在并被檢測到,因此可能出現(xiàn)假陽性的結(jié)果[28-29]。

王忠發(fā)等[30]采用快速熒光定量PCR檢測副溶血性弧菌定量的線性范圍為2×103～2×108CFU/mL,王建昌等[31]采用基于內(nèi)參的副溶血性弧菌實(shí)時熒光定量PCR，以10倍梯度稀釋的菌液經(jīng)水煮法提取DNA為模板,最低檢測限為4×102CFU/mL,張蕾[2]等采用免疫磁分離和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測得檢測限為140 CFU/mL,胡興娟[13]等采用熒光定量PCR技術(shù)得最低檢測限為72 CFU/mL。另外,相興偉[10]等采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)得檢測限50 CFU/mL。

本試驗(yàn)中,ddPCR檢測得到副溶血性弧菌有效基因組DNA濃度范圍為2～19440拷貝/20 μL,靈敏度為0.2 copies/20 μL,菌懸液濃度即檢出限為50～4.86×105CFU/mL,與3M測試片結(jié)果無顯著性差異(p>0.05)。與熒光定量PCR及LAMP等技術(shù)相比,ddPCR低濃度檢測限靈敏度高、能進(jìn)行準(zhǔn)確定量。本試驗(yàn)中當(dāng)副溶血性弧菌濃度≤4.7×103CFU/mL時,熒光PCR檢測信號較弱,需要進(jìn)行反復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果可靠性,而本實(shí)驗(yàn)中ddPCR低濃度檢測限為50 CFU/mL,操作簡單,同時ddPCR下限可以低至單拷貝,與熒光定量PCR相比不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值,能夠?qū)崿F(xiàn)真正意義上的絕對定量[32]。

以副溶血性弧菌菌懸液濃度為自變量,以對應(yīng)分析得COPY數(shù)為因變量,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線R2≥0.99,線性關(guān)系良好。以容易檢出副溶血性弧菌的鱈魚為人工污染樣品進(jìn)行特異性驗(yàn)證及梯度濃度副溶血性弧菌陽性添加,結(jié)果證明采用ddPCR技術(shù)進(jìn)行副溶血性弧菌的定量有可行性,具有實(shí)際應(yīng)用價值。

綜上,副溶血性弧菌ddPCR定量檢測技術(shù)特異性良好,副溶血性弧菌ddPCR定量結(jié)果與實(shí)際菌濃度無顯著差異(p>0.05),因此采用ddPCR技術(shù)對突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急檢測、控制疫情擴(kuò)散、提高病原菌檢出率等均有重要意義[30,33]。