李偉濤 翟淑萍 章小兵 苑偉 張北平 王百林

缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)指在一定條件下，缺血后疏通血管或再造血管使組織得到血液的再灌注不僅不能迅速恢復正常的代謝機能，反而引起更嚴重的損傷，表現(xiàn)為組織充血、水腫、組織功能障礙等。其病理生理過程復雜, 迄今尚未完全研究清楚。在復雜的肝臟外科手術中，肝臟均會不可避免地、不同程度地IRI，是導致肝切除和肝移植術后肝功能異常的重要原因[1]。通腑泄熱法是中醫(yī)下法的一種，屬于祛邪法范疇。可調暢臟腑氣機、給邪氣以出路，達到泄熱祛邪、恢復臟腑生理功能的作用[2]。本研究通過建立肝臟缺血再灌注損傷(liver ischemia reperfusion injury, HIRI)大鼠模型，通過檢測大鼠血清中白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)含量及肝組織勻漿中髓過氧化物酶(myeloperoxidase ，MPO)、過氧化氫酶(catalase,CAT)活性，探討通腑泄熱法中藥對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用及機制，為HIRI的保護提供理論基礎。

材料與方法

一、材料

1.實驗動物 6周齡Sprague-Dawley大鼠(體重250～300 g)150只，雌雄不限，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物合格證編號SCXK(粵)2013-0020，飼養(yǎng)于清潔級實驗室，室溫(22±2)℃，濕度50%～70%，自由進食、飲水，適應新環(huán)境1周。

2.用藥 通腑泄熱法方劑以茵陳蒿湯加減為主，購于廣州市紅十字會醫(yī)院：茵陳20 g，金銀花15 g，柴胡15 g，黃芩10 g，梔子10 g，大黃10 g，延胡索10 g，白芍10 g，桂枝10 g，黃芪15 g，蒲公英10 g，豬苓10 g，澤瀉15 g，芒硝5 g，每日一劑，水煎100 ml。

3.試劑 IL-6 ELISA試劑盒(批號CSB-E04640r，武漢華美生物工程有限公司)； CAT測試盒(批號A007-1)、MPO測試盒(批號A044)，均購于南京建成生物工程研究所。

4.儀器 酶標儀(美國BIO-RAD，型號：iMark)；低溫離心機 (丹麥Labogene，型號：Scanspeed 1730R)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏，型號：DNP-9162)；可見分光光度計(上海佑科，型號：UV752)；電熱恒溫水槽(國產上海一恒，型號：DK-8D)。

二、方法

1.分組 根據隨機分組原則，將150只大鼠分為缺血再灌注通腑瀉熱方中藥組(TCM組，75只)，缺血再灌注對照組(Control組，75只)，再分成缺血再灌注后1、3、6 h 3個亞組，每個亞組25只大鼠。自由進食、進水，適應1周。

2.建立模型與取材 造模開始，每日早8點、晚8點兩次予對照組大鼠5 ml生理鹽水灌胃，TCM組5 ml通腑泄熱法中藥灌胃，連續(xù)3 d，灌胃后禁食不禁水。將每組大鼠進行編號、稱重。配制1%水合氯醛按照1 ml/100 g劑量進行腹腔內注射麻醉。麻醉成功后，參照余淑珍等[3]改良大鼠急性全肝缺血再灌注模型制備方法制備模型。取腹部正中縱切口，上起劍突，顯露肝門，兩組均以無損傷血管夾阻斷肝門，觀察到肝臟組織顏色由鮮紅逐漸轉變?yōu)榘导t，完成30 min阻斷時間后，松開血管夾。用4-0絲線分兩層關腹。術后予以電熱毯加熱復溫。于缺血再灌注后1、3、6 h這3個時間點，分別對25只大鼠取材。各亞組每只大鼠每次抽取下腔靜脈血1 ml，取適量肝組織標本，制備肝組織勻漿液，離心20 min(3 000 r/min)，收集上清，置于-80 ℃冰箱保存待檢測。

三、檢測指標

分別以酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)用IL-6試劑盒定量檢測大鼠血清IL-6含量、以比色法用CAT試劑盒和MPO試劑盒檢測肝臟組織勻漿中CAT和MPO含量(嚴格按照試劑盒說明操作)。

四、統(tǒng)計學處理

結 果

一、兩組大鼠血清中IL-6含量變化

Control組1 h、3 h和6 h各時間點IL-6含量明顯高于TCM組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠肝臟缺血再灌注IL-6含量變化(ng/L)

二、各組大鼠肝臟組織勻漿液中CAT含量變化

Control組大鼠肝臟組織勻漿液中CAT含量在1 h、3 h和6 h時間點明顯低于TCM組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

表2 大鼠肝臟缺血再灌注后CAT含量變化(U/mgprot)

三、兩組大鼠肝臟組織勻漿液中MPO含量變化

Control組1 h、3 h和6 h各時間點MPO含量明顯高于TCM組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。

表3 大鼠肝臟缺血再灌注后MPO含量變化(U/克組織濕重)

討 論

HIRI仍然是肝臟外科的主要問題之一，尤其是復雜的肝臟切除或肝臟移植手術，需要在控制出血與盡量減少缺血再灌注損傷間尋求平衡。

HIRI是導致肝部分切除術和肝移植術后肝功能衰竭的主要原因，減輕術中HIRI有助于降低手術對肝功能的影響[4]，其病理生理過程復雜，迄今尚未完全研究清楚。

有研究顯示，缺血再灌注損傷有兩個階段，即早期階段和晚期階段[5]。早期階段出現(xiàn)在再灌注后6 h內，這一階段被認為是肝組織快速氧化還原反應的結果[6]。由肝細胞、庫普弗細胞、肝竇內皮細胞介導。而晚期階段主要是由于肝組織中淋巴細胞的浸潤和細胞因子和趨化因子的產生[7]。

目前預防HIRI的方法主要可以歸納為機械性干預和藥物干預，前者主要包括缺血預處理和缺血后處理[8]。

藥物干預方面，近年來，蛋白酶抑制劑、自由基清除劑、鈣通道阻滯劑、某些激素或中藥等均已被證實可從多種途徑有效抑制HIRI。我們的前期研究證實中藥對肝細胞線粒體內氧化應激所導致的損傷具有修復作用，其機制與修復肝細胞mtDNA的表達有關[9-11]。

一些中藥具有抗炎和鈣通道阻滯作用，因此也能減輕缺血再灌注損傷中的炎癥反應[12]，不過許多中藥制劑使用時必須要濃度較高還要延長中藥預處理的時間[13]，這在一定程度上限制了中藥的臨床推廣使用。

本課題通腑泄熱法方劑以茵陳蒿湯加減為主，茵陳蒿湯出自醫(yī)圣張仲景的《傷寒論》，不僅可以消退黃疸，而且具有抗肝損傷和肝纖維化的作用[14]。目前臨床上在治療阻塞性黃疸、急性黃疸型肝炎中均有使用，療效良好[15-16]。

茵陳蒿湯的主要有效成分包括蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等[17]。蘆薈大黃素的化學結構和大黃素相似，能顯著抑制肝細胞及細胞膜脂質過氧化產物丙二醛水平的升高，對肝損傷具有保護作用[18]，大黃酚可顯著抑制過氧化脂質的生成，減少組織丙二醛含量[19]，大黃素甲醚能減少氧自由基的產生，減少炎癥性細胞因子的產生，均可表現(xiàn)出對損傷的保護作用。

IL-6既是促炎細胞因子也是抗炎肌動蛋白，在人體中由IL-6 基因編碼[20]。IL-6由T細胞和巨噬細胞分泌以刺激免疫應答，在多種急慢性炎癥中，如創(chuàng)傷、燒傷、癌癥和感染等情況，體內IL-6均會升高[21]。

MPO是中性粒細胞的功能標志和激活標志，其水平及活性變化代表著嗜中性多形核白細胞的功能和活性狀態(tài)。

檢測血清中IL-6和肝組織勻漿中MPO的含量，可反映出機體炎癥反應程度。本研究結果顯示：Control組在術后不同時間點IL-6和MPO水平顯著高于TCM組(P<0.05)，表明通腑泄熱法中藥對大鼠HIRI的保護作用機制可能與抑制多種炎癥因子釋放、中性粒細胞黏附和過度活化有關。

氧自由基的生成是已知HIRI中最重要的因素之一，有效清除氧自由基，成為減輕缺血再灌注損傷的重要途徑，為減輕氧化應激反應，目前有多種辦法，一些方法已經應用于臨床[22]。

CAT可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內的過氧化氫，防止過氧化氫在鐵螯合物的作用下與O2反應產生破壞性大的羥基自由基，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關鍵酶之一。

CAT存在于所有已知動物的各個組織中，特別在肝臟中以高濃度存在。通過檢測肝臟組織勻漿中CAT的活性，可以間接獲知機體清除過氧化氫的效率，本研究結果顯示：Control組在術后不同時間點CAT含量與TCM組相比明顯下降，實驗結果具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示通腑泄熱法中藥可提高CAT含量，加速對氧自由基清除，減輕HIRI。

總之，HIRI發(fā)生機制復雜，與肝臟缺血再灌注損傷后多種炎癥因子過度表達和氧自由基損害有關，通腑泄熱法中藥能夠降低HIRI炎癥介質釋放，加速氧自由基清除，保護肝臟損傷。