王惠敏,黃丹飛△,鄒彤,李世維,鐘艾琦,王雄才

(1.長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022;2.長(zhǎng)春理工大學(xué)光電工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022)

1 引 言

光和生物組織的相互作用在19世紀(jì)中期就開(kāi)始被醫(yī)生定性地用于疾病檢測(cè)，對(duì)生物組織進(jìn)行病理診斷時(shí)采用光學(xué)的方法會(huì)有許多優(yōu)點(diǎn)，如無(wú)痛、無(wú)損以及非接觸等[1 - 2]。通常光在組織內(nèi)傳播主要存在吸收和散射兩種形式，在可見(jiàn)光波段范圍內(nèi)，生物組織大部分屬于高散射介質(zhì)[3]，因此，一般利用散射光對(duì)組織進(jìn)行成像，以探測(cè)組織結(jié)構(gòu)。在以往的普通光學(xué)成像中只是探測(cè)光波的強(qiáng)度信息，但作為光的固有屬性的偏振常被忽略。而偏振光在實(shí)際應(yīng)用中具有重要的研究?jī)r(jià)值，其能夠闡明化學(xué)鍵的空間結(jié)構(gòu)，揭露生物分子的不對(duì)稱特征，還有助于氣象學(xué)和天文學(xué)領(lǐng)域的研究，同時(shí)可以區(qū)分皮膚表面的正常和癌前細(xì)胞等[4]。

偏振測(cè)量能夠通過(guò)目標(biāo)的偏振特性得到微觀結(jié)構(gòu)和形態(tài)信息[5]，同時(shí)，增強(qiáng)圖像對(duì)比度并提升成像分辨率使圖像更加清晰。相比于普通光學(xué)成像，偏振成像在獲取光強(qiáng)分布的基礎(chǔ)上增加了偏振信息維度，更容易得到目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)信息，有效改善了傳統(tǒng)成像的不足[6 - 7]。生物組織本身的偏振特性可以由其穆勒矩陣充分表征，正常組織和癌變組織具有不同的偏振光學(xué)性質(zhì)，我們?cè)噲D采用偏振成像技術(shù)，測(cè)量癌癥切片的穆勒矩陣，以探究穆勒矩陣偏振成像區(qū)分癌變和非癌變組織的能力。

目前，利用穆勒矩陣進(jìn)行癌癥檢測(cè)的研究并不多，主要是清華大學(xué)實(shí)驗(yàn)室搭建的穆勒矩陣成像系統(tǒng)，而該系統(tǒng)對(duì)樣品穆勒矩陣的獲取方法是HV法，通過(guò)測(cè)量36個(gè)反射率，將入射光以6種偏振態(tài)入射，相對(duì)應(yīng)地6種偏振態(tài)出射，從而聯(lián)立36個(gè)方程組求得樣品的穆勒矩陣，但這種方法還需要旋轉(zhuǎn)起偏和檢偏模塊的兩個(gè)偏振片。而本研究采用雙旋轉(zhuǎn)波片法[8 - 9]固定偏振片，只旋轉(zhuǎn)1/4波片，搭建了一套穆勒矩陣成像系統(tǒng)，對(duì)肝癌、肺癌和胃癌三種病理組織切片進(jìn)行穆勒矩陣測(cè)量。

2 穆勒矩陣成像系統(tǒng)設(shè)計(jì)

光路采用斜入射，正接收的方式，成像系統(tǒng)見(jiàn)圖1。CCD接收組織切片的背向散射光，散射光中的偏振成分?jǐn)y帶了組織結(jié)構(gòu)信息。

圖1 成像系統(tǒng)示意圖

其中，光源為中心波長(zhǎng)630 nm，功率1 W的面光源LED；P1和P2分別為偏振片，R1和R2為1/4波片，采用武漢優(yōu)光科技公司的632.8 nm波長(zhǎng)的膠合真零級(jí)波片；CCD采用維視數(shù)字圖像技術(shù)有限公司的MV-VEM033SC，分辨率640×480；LED發(fā)出的光經(jīng)過(guò)準(zhǔn)直透鏡L1以及由P1和R1構(gòu)成的起偏模塊照射到組織切片，然后由切片背向散射通過(guò)R2和P2組成的檢偏模塊，最后通過(guò)成像透鏡L2被CCD探測(cè)。

為了測(cè)量組織切片的穆勒矩陣，需調(diào)制入射和出射光的偏振態(tài)，使用Arduino Uno和步進(jìn)電機(jī)作為偏振態(tài)調(diào)制的控制部件。實(shí)驗(yàn)中，P1和P2固定且透光軸與水平方向平行，R1及R2的快軸與水平方向平行，步進(jìn)電機(jī)以恒定的角速度帶動(dòng)R1與R2按照1:5的角度旋轉(zhuǎn)。R1與R2從0°開(kāi)始分別以6°和30°為步長(zhǎng)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，從而調(diào)制入射光和出射光的偏振態(tài)。調(diào)制期間CCD相應(yīng)的采集30幅變換的光強(qiáng)圖像，根據(jù)光強(qiáng)傅里葉系數(shù)最后求得穆勒矩陣的各個(gè)元素。整個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置由計(jì)算機(jī)控制，一次穆勒矩陣的測(cè)量時(shí)間大約為2 min，在Matlab平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)圖像采集和處理的過(guò)程。

3 實(shí)驗(yàn)原理與系統(tǒng)誤差校正

3.1 穆勒矩陣測(cè)量原理

通常情況下，光的偏振態(tài)可由斯托克斯矢量法、邦加球法、瓊斯矢量法和三角函數(shù)法來(lái)描述[10]，以上方法中，邦加球法直觀但不便于定量分析，瓊斯矢量法只能描述完全偏振光，而斯托克斯矢量法則能夠描述部分偏振光，完全偏振光以及非偏振光，考慮到光與組織切片的相互作用，采用斯托克斯矢量法描述入射光和出射光的偏振態(tài)。

一束光與目標(biāo)相互作用后，偏振態(tài)將會(huì)發(fā)生改變。出射光的斯托克斯矢量通?？捎赡繕?biāo)的穆勒矩陣和入射光的斯托克斯矢量乘積求得，即S′=MS，M為目標(biāo)的穆勒矩陣，表示目標(biāo)的偏振光學(xué)特性，即對(duì)入射光偏振態(tài)的影響，S′和S分別代表出射光和入射光的斯托克斯矢量。

在圖1所示的光路系統(tǒng)中，入射光的斯托克斯矢量記為Sin；偏振片P1和P2固定其透光軸與水平方向平行，穆勒矩陣分別記為P1和P2，1/4波片R1和R2的快軸與水平方向的夾角分別為θ和5θ，穆勒矩陣分別記為R1和R2，切片的穆勒矩陣記為M，出射光的斯托克斯矢量記為Sout。則：

Sout=P2R2MR1P1Sin

(1)

這里將式(1)表示成：

Sout=AMP

(2)

A=P2R2；P=R1P1Sin；M為一個(gè)4×4的矩陣記為(mij)i,j=1,2,3,4；

Sout=[s0s1s2s3]TSin=[1 0 0 0]T

(3)

P1和P2[11]相等如下：

(4)

R1和R2[11]分別為式(5)和式(6)：

(5)

(6)

因?yàn)槌錾涔馑雇锌怂故噶康牡谝粋€(gè)分量即是CCD所探測(cè)到的光強(qiáng)，所以組織切片散射后的光強(qiáng)可由式(7)表示。其中ai為A的第一行元素，pi為P的所有元素。

(7)

可將該式表示成式(8)所示的形式：

(8)

由以上公式推導(dǎo)出：

(9)

由此可以得到傅里葉系數(shù)即a0-a12，b1-b12與穆勒矩陣元素成函數(shù)關(guān)系，見(jiàn)表1。

表1a0-a12，b1-b12與穆勒矩陣元素的關(guān)系

Table 1 Relationship of a0-a12，b1-b12and Mueller matrix elements

所以，求出光強(qiáng)的傅里葉系數(shù)便可求出介質(zhì)的穆勒矩陣。

3.2 系統(tǒng)誤差校正

系統(tǒng)在運(yùn)行時(shí)，對(duì)樣品的穆勒矩陣測(cè)量并不能達(dá)到理想的狀態(tài)，將上述實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行誤差分析，可以發(fā)現(xiàn)裝置關(guān)于光源的單色性、偏振片的透光軸、1/4波片的光軸及相位延遲以及CCD等方面可能存在系統(tǒng)誤差。通過(guò)測(cè)量空氣介質(zhì)的穆勒矩陣，對(duì)成像裝置進(jìn)行了誤差校正。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

光與組織切片相互作用后其偏振態(tài)將會(huì)發(fā)生改變，偏振狀態(tài)的改變表達(dá)了組織的偏振特性。前人的研究結(jié)果指出穆勒矩陣的16個(gè)像元中，第一個(gè)像元m11代表目標(biāo)對(duì)入射光強(qiáng)的散射或者反射能力，第一行的m12、m13及m14體現(xiàn)的是雙向衰減特性，第一列的m21、m31及m41為與偏振度有關(guān)的參數(shù)，其余九個(gè)像元?jiǎng)t是和散射退偏及相位延遲有關(guān)的參量。分別針對(duì)肝癌，肺癌和胃癌組織進(jìn)行測(cè)量，切片樣本均未染色且未加蓋玻片。圖2為肝癌的穆勒矩陣成像結(jié)果。

圖2 (a).未染色的肝癌切片，(b).肝癌組織的穆勒矩陣，(c).m23像元，(d).m44像元

圖(a)為測(cè)量所使用的未染色肝癌切片樣本，藍(lán)色標(biāo)注區(qū)域大致為癌變組織，其余為非癌變組織。從圖(b)成像結(jié)果可以看出，穆勒矩陣包含了組織大量的結(jié)構(gòu)信息，每個(gè)矩陣元表達(dá)的偏振特性不盡相同，除了體現(xiàn)強(qiáng)度特性的m11外，其中陣元m22、m33及m44和m23的值比較大，且這幾個(gè)陣元代表的偏振特性癌變與非癌變組織存在明顯差異。圖(c)中癌變的偏振特性值達(dá)到了0.3以上，而非癌變的幾乎為0；圖(d)中，癌變的值達(dá)到0.35左右，非癌變的值接近0.1。從以上肝癌的穆勒矩陣結(jié)果發(fā)現(xiàn)，癌變與非癌變組織在某些穆勒矩陣元中偏振特性有著顯著區(qū)別，穆勒矩陣可以輔助區(qū)分癌變與非癌變區(qū)域。

肺癌的偏振成像結(jié)果見(jiàn)圖3，圖(a)為測(cè)量使用的肺癌切片，藍(lán)色標(biāo)注區(qū)域大致為癌變組織。圖(b)m31顯示的偏振特性癌變區(qū)域的值大部分接近0，右邊的正常組織則達(dá)到0.45左右；圖(c)m44像元體現(xiàn)的偏振特性左邊的癌變組織的值比右邊的正常組織整體偏低，基本趨近于0，右邊的非癌變組織的值近乎在0.18以上，此兩個(gè)像元表明可以輔助將癌變和非癌變區(qū)域加以區(qū)分。

圖4為胃癌組織切片的成像結(jié)果，圖(a)是測(cè)量的胃癌切片樣本，藍(lán)色曲線內(nèi)大致為癌變組織，從圖(b)m13和圖(c)m44像元體現(xiàn)的偏振特性能夠看出癌變組織的整體高于非癌變組織，兩者的偏振特性差異明顯，同樣表明穆勒矩陣具有區(qū)分癌變和非癌變組織的潛力。

圖3 肺癌 (a).未染色切片，(b).m31像元，(c).m44像元

圖4 胃癌 (a).未染色切片，(b).m13像元，(c)m44像元

5 結(jié)論

本研究利用偏振成像的優(yōu)勢(shì)，基于雙旋轉(zhuǎn)波片法搭建了一套穆勒矩陣自動(dòng)測(cè)量系統(tǒng)，整體實(shí)驗(yàn)裝置由計(jì)算機(jī)控制，介紹了裝置結(jié)構(gòu)，測(cè)量原理及實(shí)驗(yàn)過(guò)程。以肝癌，肺癌，和胃癌組織切片為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行穆勒矩陣的測(cè)量，結(jié)果表明，成像系統(tǒng)運(yùn)行良好，能夠正確測(cè)量組織切片的穆勒矩陣。通過(guò)對(duì)獲得的穆勒矩陣圖像進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)肝癌組織切片的m22、m23、m33和m44像元癌變區(qū)域與非癌變區(qū)域偏振信息差異顯著；肺癌的m31和m44像元體現(xiàn)的偏振特性癌變區(qū)域的整體表現(xiàn)比較低，非癌變區(qū)域則較高；胃癌的m13和m44像元顯示的偏振特性癌變組織整體偏高，而非癌變組織的整體偏低。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)某些像元中癌變和非癌變組織的偏振特性差異明顯，可以輔助區(qū)分癌變和非癌變組織，穆勒矩陣偏振成像在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)?huì)有廣闊的發(fā)展前景。