韓運(yùn)寧，亓建洪，曲鵬瑋，張凱紅，畢懿康，周路，宋洪強(qiáng)，謝地

(泰山醫(yī)學(xué)院 運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所，山東 泰安 271000)

1 引 言

膝關(guān)節(jié)軟骨損傷是最常見的運(yùn)動(dòng)損傷之一，由于膝關(guān)節(jié)軟骨無(wú)血管神經(jīng)分布，一旦損傷很難完成自身修復(fù)。同種異體軟骨來(lái)源廣泛，移植后無(wú)排斥反應(yīng)，可形成符合生物力學(xué)要求的透明軟骨，成為治療軟骨缺損的理想方法。同種異體軟骨移植術(shù)在美國(guó)應(yīng)用廣泛，臨床跟蹤研究顯示同種異體軟骨移植手術(shù)的成功率達(dá)到75%以上[1]，79%的患者可以恢復(fù)到受傷前的運(yùn)動(dòng)水平[2]。軟骨移植物在移植前需要進(jìn)行常規(guī)的病原微生物檢測(cè)，該過(guò)程至少需要7 d，而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，軟骨細(xì)胞存活率會(huì)逐漸下降。文獻(xiàn)[3]報(bào)道只有當(dāng)體外軟骨細(xì)胞存活率達(dá)到70%以上，才能保證移植后的手術(shù)效果。如何在保證軟骨細(xì)胞達(dá)到較高存活率的情況下延長(zhǎng)體外保存時(shí)間，成為同種異體軟骨移植手術(shù)能否大量應(yīng)用的關(guān)鍵。軟骨組織體外保存時(shí)的細(xì)胞活性受多種因素影響。換液頻率與軟骨細(xì)胞的新陳代謝密切相關(guān)，同時(shí)軟骨保存過(guò)程中保存液的用量也與換液頻率有關(guān)，篩選出合適的換液頻率可以維持保存過(guò)程中軟骨細(xì)胞的活性，同時(shí)有利于降低軟骨庫(kù)及軟骨移植手術(shù)的成本。因此，我們研究應(yīng)用組織培養(yǎng)法時(shí)，換液頻率對(duì)關(guān)節(jié)軟骨體外保存效果的影響。

2 材料和方法

2.1 材料

選擇來(lái)自附近農(nóng)場(chǎng)的體重約100 kg的本地健康豬。利用專業(yè)骨軟骨取材器械A(chǔ)RTHREX骨軟骨移植器械在豬膝關(guān)節(jié)股骨髁關(guān)節(jié)面內(nèi)外側(cè)負(fù)重區(qū)獲取圓柱狀骨軟骨塊60枚，長(zhǎng)10 mm，直徑為6 mm[4]。

2.2 方法

2.2.1保存方法 保存液采用含有雙抗的DMEM(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)保存液。將所取的軟骨隨機(jī)分為3組：A組(不換液)20枚；B組(每7 d換液)20枚；C組(每2 d換液)20枚。將軟骨置于4℃條件下保存。28 d后檢測(cè)軟骨細(xì)胞存活率、組織形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)性能。

2.2.2細(xì)胞存活率檢測(cè) 用振動(dòng)切片機(jī)垂直于軟骨表面縱切成 60 um 厚的組織切片；置于50 mg/L FDA(fluorescein diacetate，F(xiàn)DA)溶液和10 mg/L EB(ethidium bromide，EB)溶液的混合液中染色，在熒光顯微鏡 450 nm 波長(zhǎng)激光激發(fā)下觀察，視野中呈現(xiàn)綠色的為活細(xì)胞，紅色為死細(xì)胞。采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)數(shù)并計(jì)算軟骨細(xì)胞存活率=(活細(xì)胞數(shù)目/活細(xì)胞與死細(xì)胞數(shù)目之和)×100%。

2.2.3形態(tài)學(xué)檢測(cè) 將軟骨標(biāo)本用4%多聚甲醛溶液固定，然后進(jìn)行脫鈣，石蠟包埋，組織切片等操作。對(duì)切片進(jìn)行番紅O染色觀察，并采用Image Pro Plus 6.0圖像分析IOD值(積分光密度)，然后對(duì)染色圖片進(jìn)行分析比較。

2.2.4生物力學(xué)檢測(cè) 使用英斯特朗生物力學(xué)測(cè)試機(jī)檢測(cè)軟骨的生物力學(xué)特性。預(yù)壓縮壓力設(shè)定為5.0 N，以0.1 mm/s的速度對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，由力學(xué)測(cè)試軟件計(jì)算出楊氏模量值進(jìn)行比較。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞存活率

使用FDA-EB混合染液對(duì)切片進(jìn)行染色，并用Image J圖像分析軟件計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算軟骨細(xì)胞存活率。由圖1可見A、B、C三組軟骨細(xì)胞均出現(xiàn)大量死亡， A組和B組死亡最多，細(xì)胞存活率僅為15.63%和16.98%。C組相對(duì)于A、B兩組存活率較高，達(dá)到26.76%。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析得到圖2柱狀統(tǒng)計(jì)圖，從統(tǒng)計(jì)圖中可以看出28 d后細(xì)胞存活率比較，A組和B組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，C組存活率優(yōu)于A組和B組(P<0.05)。

3.2 形態(tài)學(xué)檢測(cè)

圖3為番紅O染色圖片。番紅O染色可將軟骨中的蛋白多糖成分染成紅色。通過(guò)染色圖片可以看出，A組和B組顏色淺，表明軟骨基質(zhì)中的蛋白多糖含量低。C組的著色要明顯高于A組和B組，即C組軟骨基質(zhì)中的蛋白多糖含量較多。分析番紅O染色圖片IOD值，評(píng)價(jià)軟骨蛋白多糖的含量。由圖4可見A組的IOD值和B組IOD值沒有明顯的差別，C組IOD值高于A組和B組(P<0.05)。表明C組蛋白多糖含量要高于A組和B組。

圖1FDA-EB熒光染色結(jié)果(×100倍)。綠色示活細(xì)胞；紅色示死細(xì)胞。

Fig1CartilagesectionstainingwithFDA-EBfluorescence(×100magnification).greenfluorescence,viablecells;redfluorescence,deadcells

圖2 A、B、C三組之間細(xì)胞存活率比較(***P<0.001)

Fig2Comparisonofthechondrocyteviabilityinthethreegroups(***P<0.001)

3.3 生物力學(xué)

由英斯特朗生物力學(xué)測(cè)試機(jī)得到各組軟骨的楊氏模量。通過(guò)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，A組和B組楊氏模量沒有明顯的差別，C組楊氏模量?jī)?yōu)于A組和B組(見圖5)。楊氏模量反應(yīng)軟骨的生物力學(xué)性能， 表明C組軟骨的生物力學(xué)性能最好。

圖3 番紅O染色結(jié)果(x40倍)

圖4 各組間IOD值比較(**P<0.01)

圖5 生物力學(xué)結(jié)果(**P<0.01)

4 討論

組織培養(yǎng)法保存關(guān)節(jié)軟骨，能夠模擬體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，為軟骨提供新陳代謝所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，最多可以將保存期延長(zhǎng)至65 d[5]。組織培養(yǎng)法保存關(guān)節(jié)軟骨成為同種異體軟骨移植研究的熱點(diǎn)。目前，優(yōu)化保存方案的研究主要集中于保存液成分和保存環(huán)境。Pennock等人的研究發(fā)現(xiàn)向EMEM培養(yǎng)液中加入10%的新鮮胎牛血清(FBS)可以提高保存期內(nèi)軟骨細(xì)胞的存活率[6]。但是異體的血清可能會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)，也會(huì)增加疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。向DMEM培養(yǎng)液中添加胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)也可以提高同種異體軟骨的保存效果[7]。此外，還有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)、腫瘤壞死因子α(TNFα)的抑制劑依那西普、地塞米松等，均被證實(shí)可以在不同方面提高軟骨的保存效果[8-10]。對(duì)于保存環(huán)境，研究人員從溫度、力學(xué)環(huán)境等方面入手進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。Lsprsde等人的研究發(fā)現(xiàn)4℃條件下可以減緩軟骨細(xì)胞的代謝，維持原有的細(xì)胞外基質(zhì)成分[11]。Qi等人在4℃下保存軟骨并在28 d后檢測(cè)軟骨細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4℃條件下的保存效果優(yōu)于37℃條件下的保存[12]。關(guān)于最佳的保存溫度還在爭(zhēng)論中，37℃，25℃，4℃均有報(bào)道為最佳保存溫度[5,11-14]，需要根據(jù)其他保存條件選擇合適的保存溫度。此外，模擬關(guān)節(jié)軟骨體內(nèi)的應(yīng)力環(huán)境，在體外對(duì)軟骨施加適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激，也可以提高保存效果[15-17]。對(duì)于保存期間保存液的換液頻率此前并沒有報(bào)道。

雖然軟骨庫(kù)中保存的是骨軟骨組織塊，其內(nèi)部細(xì)胞每時(shí)每刻都與外界進(jìn)行著物質(zhì)交換。篩選出合適的換液頻率有利于軟骨細(xì)胞汲取保存液的養(yǎng)分維持自身的新陳代謝，同時(shí)可以為軟骨庫(kù)的建立提供理論依據(jù)，減少保存液的浪費(fèi)，降低軟骨庫(kù)運(yùn)營(yíng)成本。軟骨細(xì)胞存活率是評(píng)價(jià)保存效果的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。本研究中，由于選用了基礎(chǔ)培養(yǎng)液，所以保存28 d后各組軟骨細(xì)胞存活率均出現(xiàn)了明顯的下降。但是采取每2 d換液的一組細(xì)胞存活率明顯高于不換液組和每7 d換液組。正常人的軟骨組織中無(wú)血管和神經(jīng)，其營(yíng)養(yǎng)成分的供給依靠關(guān)節(jié)腔中的關(guān)節(jié)液。組織培養(yǎng)法保存關(guān)節(jié)軟骨，模擬關(guān)節(jié)軟骨所處的液體環(huán)境，保存液中含有多種細(xì)胞生存所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以為軟骨細(xì)胞的新陳代謝提供必要的營(yíng)養(yǎng)。蛋白多糖是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，具高度親水性，對(duì)保持組織水分及物質(zhì)交換均有重要作用。實(shí)驗(yàn)中每2 d換液組的蛋白多糖含量最高，可以維持軟骨組織的生物學(xué)性能。關(guān)節(jié)軟骨的生物力學(xué)性能是評(píng)價(jià)軟骨保存效果的重要指標(biāo)，本研究中每2 d換液組的楊氏模量明顯優(yōu)于不換液組和每7 d換液組。有研究表明，軟骨組織的基質(zhì)成分變化會(huì)導(dǎo)致軟骨的粘彈性改變[18]。每2 d換液可以維持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白多糖含量，同時(shí)維持了軟骨的生物力學(xué)性能。軟骨細(xì)胞合成分泌各種細(xì)胞外基質(zhì)，軟骨細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的形成和維持有重要的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)反過(guò)來(lái)也調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的功能，影響著軟骨細(xì)胞的新陳代謝。

綜上，組織培養(yǎng)法保存關(guān)節(jié)軟骨時(shí)，采取每2 d更換一次培養(yǎng)液的方案可以提高關(guān)節(jié)軟骨的體外保存效果，對(duì)以后軟骨組織庫(kù)的建立提供參考。