林樹乾 秦炳燕 馮敏燕 李桂明 楊世發(fā) 趙增成 傅劍 黃中利

摘要：為了解細(xì)菌抗藥性的種間傳遞，本試驗(yàn)將抗藥的鴨疫里默氏桿菌RA P3菌株和不抗藥的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株8099混合傳代培養(yǎng)，篩選傳代培養(yǎng)后出現(xiàn)的大腸桿菌抗藥菌株，之后對(duì)獲得的抗藥大腸桿菌菌株K-8099和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株8099及鴨疫里默氏桿菌RA P3菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和抗藥基因檢測(cè)。結(jié)果表明鴨疫里默氏桿菌RA P3的抗藥基因傳遞給了不抗藥的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株8099，且大腸桿菌抗藥株K-8099的抗藥水平顯著提高。說明在混合感染過程中，鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌的的抗藥性確實(shí)可以發(fā)生種間傳遞。

關(guān)鍵詞：鴨疫里默氏桿菌；大腸桿菌；混合傳代培養(yǎng)；抗藥性傳遞

中圖分類號(hào)：S852.61文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）07-0027-06

Abstract In order to know the interspecific drug-resistance transfer of bacteria， RA P3 strain from Riemerella anatipestifer with drug-resistance and E.coli standard strain 8099 sensitive to the antibiotics were selected for mixed subculture to screen out the appeared E.coli strain with drug-resistance. Then， we tested the drug sensitive and resistance gene in E.coli strain K-8099 with drug-resistance from mixed subculture， E.coli standard strain 8099 and RA P3 strain in the study. The results showed that the resistance gene from RA P3 strain was transfered into E.coli standard strain 8099， and the drug-resistance of E.coli strain K-8099 was significant improved. This study proved that interspecific drug resistance transfer could really happen between Riemerella anatipestifer and E.coli in the mixed infection process.

Keywords Riemerella anatipestifer； Escherichia coli； Mixed subculture；Drug-resistance transfer

鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌均為嚴(yán)重危害鴨養(yǎng)殖業(yè)的主要病原菌[1]。鴨疫里默氏桿菌對(duì)2～8周齡雛鴨危害性最大，發(fā)病率為5%～90%，死亡率高達(dá)90%[2]。大腸桿菌是造成家禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的病原體，也是禽肉加工中造成胴體報(bào)廢的主要原因，僅因?yàn)榇竽c桿菌敗血癥導(dǎo)致的胴體報(bào)廢率就達(dá)到43%[3]。大腸桿菌與鴨疫里默氏桿菌盡管有相似的形態(tài)，但屬于不同科屬，大腸桿菌為腸桿菌科大腸桿菌屬，鴨疫里默氏桿菌先后被列入莫拉氏菌屬、巴氏桿菌屬，1993年Segers等根據(jù)培養(yǎng)特性、16S rRNA序列和表型，建議將其獨(dú)立出來成為黃桿菌科下的鴨疫里默氏桿菌屬[4]。這兩種臨床上常見的致病菌，常常出現(xiàn)混合感染、繼發(fā)感染[5-7]。由于在養(yǎng)殖業(yè)中常常不合理地使用抗生素，這兩種菌的抗藥性和抗藥譜不斷擴(kuò)大[8-11]。臨床上雖然在藥敏試驗(yàn)的基礎(chǔ)上指導(dǎo)用藥，但實(shí)際治療效果往往不佳，這很可能是因?yàn)檫@兩種菌混合感染時(shí)其各自不同的抗藥性發(fā)生了種間傳遞，使得每種菌的抗藥性都增加，抗菌譜擴(kuò)大，導(dǎo)致治療失敗。本研究將不抗藥的大腸桿菌菌株與抗藥的鴨疫里默氏桿菌菌株共同傳代培養(yǎng)，檢驗(yàn)是否能篩選出抗藥大腸桿菌菌株，以期為細(xì)菌抗藥性的種間傳遞提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

鴨疫里默氏桿菌抗藥菌株（RA P3）是本實(shí)驗(yàn)室從2014年山東地區(qū)鴨疫里默氏桿菌病死鴨的肝臟中分離所得；大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株8099（EC 8099），購自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×Power Taq PCR MasterMix、6×Loading Buffer、50×TAE電泳緩沖液（pH8.5），購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司； DL2000 DNA Marker，購自北京天根生物技術(shù)有限公司；Regvlar Agarose G-10，購自Biowest公司；慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品、妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)品、阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)品、環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品、氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品、諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，均購自中國藥品生物制品檢定所；藥敏試紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 儀器

手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；DHP-500電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器（常州普天儀器制造有限公司）；JHT-系列凈化工作臺(tái)（濟(jì)南潔康凈化設(shè)備廠）； 311型 CO2 培養(yǎng)箱（Thermo Fisher）；PCR擴(kuò)增儀；GenoSens 1800系列凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 RA P3和EC8099菌株的藥敏試驗(yàn) 采用藥敏試紙片法（K-B法）[12]進(jìn)行RA P3和EC 8099對(duì)3種氨基糖苷類（妥布霉素、慶大霉素、阿米卡星）和3種喹諾酮類（氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星）共6種抗生素的藥敏試驗(yàn)。取游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測(cè)量抑菌圈直徑，以沒有明顯肉眼可見物區(qū)域?yàn)橐志吘?。試?yàn)時(shí)大腸桿菌接種在普通營養(yǎng)瓊脂中，鴨疫里默氏桿菌接種在含4%血清的TSA瓊脂中。

1.4.2 鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌混合培養(yǎng) 按照李翠等[13]的方法對(duì)RA P3和EC 8099進(jìn)行體外混合傳代培養(yǎng)。第一代將5 μL用含4%血清的TSA培養(yǎng)基活化培養(yǎng)24 h的RA P3菌液接種到4 mL含4%血清的TSB 培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)14～18 h，剛見渾濁時(shí)，再將活化的5 μL大腸桿菌菌液加入到上述培養(yǎng)基中，繼續(xù)同樣條件混合培養(yǎng)12 h。以后各代除了用5 μL上一代混合培養(yǎng)12 h的菌液代替活化的5 μL大腸桿菌菌液外，其它程序和接種培養(yǎng)條件同第一代。共傳代50次。每一代皆吸取100 μL混合培養(yǎng)菌液，涂布于含4%血清的TSA平板，置CO2恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)9～12 h，觀察兩種菌的生長(zhǎng)情況。

1.4.3 篩選抗藥性大腸桿菌菌株 每一次混合傳代培養(yǎng)12 h后，皆吸取100 μL混合培養(yǎng)菌液，分別涂布于含慶大霉素（4 μg/mL）、妥布霉素（4 μg/mL）、阿米卡星（16 μg/mL）、氧氟沙星（0.5 μg/mL）、環(huán)丙沙星（0.5 μg/mL）、諾氟沙星（1 μg/mL）的麥康凱抗性篩選板，置CO2恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)20～24 h。由于鴨疫里默氏桿菌在麥康凱平板上不生長(zhǎng)，所以在麥康凱抗性板上生長(zhǎng)的菌株即為抗藥的大腸桿菌菌株。上述各篩選板所含抗生素濃度，為歐洲藥敏試驗(yàn)聯(lián)合委員會(huì)（EUCAST）2017歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)所列出的大腸桿菌對(duì)抗生素的耐受折點(diǎn)值。

1.4.4 抗藥大腸桿菌與EC 8099藥敏試驗(yàn)的比較 先挑取在麥康凱抗性板上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，之后利用藥敏試紙片法（K-B法）進(jìn)行抗藥大腸桿菌與EC 8099對(duì)3種氨基糖苷類（妥布霉素、慶大霉素、阿米卡星）和3種喹諾酮類（氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星）共6種抗生素的對(duì)比藥敏試驗(yàn)。

1.4.5 抗藥大腸桿菌與EC 8099最低抑菌濃度的比較 根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，采用試管雙倍稀釋法[12]，對(duì)EC 8099及抗藥大腸桿菌進(jìn)行抗生素最低抑菌濃度（MIC）檢測(cè)。

1.4.6 抗藥基因檢測(cè) 上述試驗(yàn)篩選得到的抗藥大腸桿菌耐受氨基糖苷類藥物，所以選取論文中已發(fā)表的氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶基因aac6-Ⅰ[14]及aac3-Ⅱ[15]、氨基糖苷腺苷轉(zhuǎn)移酶基因aadA1[16]、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因aph（3′）-Ⅲ [17]的引物序列（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。通過PCR檢測(cè)RA P3、EC 8099及混合傳代后篩選到的抗藥大腸桿菌有無抗藥基因。各基因引物序列見表1。

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取RA P3、EC 8099及混合傳代后篩選到的抗藥大腸桿菌的基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系見表2。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后的產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RA P3和EC 8099藥敏測(cè)定結(jié)果

從表3可以看出，RA P3耐受這6種抗生素；而根據(jù)EUCAST 2017歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，EC 8099對(duì)這6種抗生素皆敏感。

2.2 混合傳代培養(yǎng)

混合培養(yǎng)過程中，基本每一代都能得到如圖1所示的培養(yǎng)結(jié)果，奶油狀透明的小菌落為鴨疫里默氏桿菌，白色大菌落為大腸桿菌，兩者的菌落數(shù)量大體一致。

2.3 抗藥大腸桿菌篩選結(jié)果

在混合傳代培養(yǎng)后篩選抗藥菌株過程中，含環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的麥康凱抗性板上一直無菌落出現(xiàn)；含阿米卡星的麥康凱抗性板上在27代有單個(gè)菌落，含慶大霉素的麥康凱抗性板上36代有多個(gè)菌落，含妥布霉素的麥康凱抗性板上在37代有3個(gè)菌落（圖2）。挑取各個(gè)抗性板上的單個(gè)菌落繼續(xù)在相應(yīng)抗性的麥康凱抗性板上傳代，僅第27代篩選得到的抗藥菌株可以在含阿米卡星抗性板上穩(wěn)定生長(zhǎng)，命名為大腸桿菌K-8099（EC K-8099）。

2.4 EC 8099與EC K-8099藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較

從圖3、4可以直觀看出，EC K-8099菌株獲得對(duì)3種氨基糖苷類抗生素的抗藥性，但仍然不耐受3種喹諾酮類藥物。

2.5 EC 8099與EC K-8099最低抑菌濃度的比較

從表4可以看出，EC K-8099對(duì)三種氨基糖苷類抗生素的MIC顯著高于EC 8099。

2.6 抗藥基因檢測(cè)

如圖5、6所示，從RA P3菌株及大腸桿菌抗藥菌株K-8099檢測(cè)到了一條486 bp的條帶，為aac6-Ⅰ基因，但未檢測(cè)到其他基因。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株8099未檢測(cè)到任何抗藥基因。

3 討論與結(jié)論

隨著全球細(xì)菌抗藥性問題越來越嚴(yán)重，人們一直在研究探索抗藥性產(chǎn)生的機(jī)理。目前認(rèn)為細(xì)菌的抗藥性來源包括兩個(gè)途徑：一個(gè)是細(xì)菌自身基因突變產(chǎn)生新的抗藥基因。這種突變主要發(fā)生于染色體DNA，質(zhì)粒DNA或轉(zhuǎn)座子DNA也可發(fā)生，而且除結(jié)構(gòu)基因外的某些調(diào)節(jié)基因突變也可導(dǎo)致細(xì)菌抗藥性的產(chǎn)生。但這類自發(fā)突變的機(jī)率很小，約為 10-6～10-8，更多的是由理化因素誘發(fā)突變而產(chǎn)生抗藥基因。由于在不穩(wěn)定的環(huán)境因素選擇下，細(xì)菌通常很難形成穩(wěn)定的抗藥性菌株，因此，自身基因突變并不是造成如今細(xì)菌抗藥局面的主要原因[18]。捕獲外源抗藥基因是細(xì)菌獲得抗藥性的另一個(gè)重要途徑。外源性抗藥基因可以位于其染色體片段上，也可由質(zhì)粒攜帶[19]。在外界環(huán)境誘導(dǎo)下，質(zhì)粒攜帶的這些可移動(dòng)的遺傳因子可在不同的種屬間傳遞；還可通過轉(zhuǎn)座子[20，21]或整合子/基因盒[22-25]將位于染色體上的抗藥基因進(jìn)行種屬間傳遞，引起遺傳信息重新排列。這樣不但傳遞了抗藥性，而且更容易產(chǎn)生多重抗藥菌株。細(xì)菌由這種捕獲方式獲得抗藥性的機(jī)率高，是引起抗藥性的主要原因[26，27]。

鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌的培養(yǎng)條件相差很大，使用同一種培養(yǎng)基培養(yǎng)兩種菌，若大腸桿菌具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，則會(huì)抑制鴨疫里默氏桿菌的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)室通過多次摸索，首先確定了在連續(xù)傳代情況下兩種菌能共同生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件，并建立了體外混合培養(yǎng)及重新分離這兩種細(xì)菌的方法[13]。

篩選抗藥性大腸桿菌試驗(yàn)中，在慶大霉素、妥布霉素及阿米卡星麥康凱抗性板上均篩選到了單個(gè)菌落；讓這些單個(gè)菌落繼續(xù)在相應(yīng)抗性板上傳代，其中僅阿米卡星抗性板上的菌落能穩(wěn)定遺傳。說明捕獲的抗藥性，未必能穩(wěn)定遺傳。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，篩選獲得的大腸桿菌抗藥菌株K-8099獲得了氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶基因aac6-Ⅰ，且對(duì)氨基糖苷類的妥布霉素、慶大霉素和阿米卡星的最低抑菌濃度較大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株8099顯著增加。氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶基因aac6-Ⅰ基因存在于RA P3菌株的染色體DNA中，而在大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株8099中未檢測(cè)到，由此判斷該抗藥基因是由鴨疫里默氏桿菌向大腸桿菌傳遞而來，可能是通過轉(zhuǎn)座子或者整合子在這兩種不同種屬的細(xì)菌間進(jìn)行基因傳遞。

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