夏有君，陳笑笑，陳建鋒，杜文強，趙 鋼，褚家如

(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 精密機械與精密儀器系，安徽 合肥 230027)

細胞微環(huán)境對細胞的分化、生長和遷移等行為具有重要的調(diào)控作用。細胞的物理微環(huán)境性質(zhì)主要由細胞外基質(zhì)決定。細胞外基質(zhì)是一種錯綜的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其復(fù)雜的拓撲結(jié)構(gòu)和力學(xué)性質(zhì)對細胞的遷移與增殖具有重要影響[1-3]。然而，傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)是在二維平面玻璃板或者塑料板上進行，這與體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境有很大不同，往往也造成了體外細胞實驗無法真實地模擬體內(nèi)微環(huán)境對細胞行為的影響[4-5]。隨著微納米加工技術(shù)的發(fā)展，研究人員在細胞培養(yǎng)基底上制備出微納米拓撲結(jié)構(gòu)，以用于研究物理微環(huán)境對細胞行為的調(diào)控作用。大量研究報道了以一定的有序圖案或空間梯度分布的微溝槽、微孔和微柱基底可以對細胞行為進行調(diào)控[6-10]。

細胞遷移在癌癥轉(zhuǎn)移、傷口愈合和胚胎發(fā)育等生理和病理過程中有著重要意義[11-14]。研究表明，細胞的遷移特性有賴于細胞微環(huán)境的形貌及幾何尺寸，不同種類的細胞對細胞拓撲微環(huán)境的響應(yīng)卻不同，例如，胚胎干細胞在高剛度基底上趨向于分化為成骨細胞；而在低剛度基底上趨向于分化為脂肪細胞[15]。盡管有大量研究報道了單一種類細胞對物理微環(huán)境的遷移研究，但體內(nèi)組織是多種類細胞共同生長，因此有必要研究共培養(yǎng)多種類細胞對相同物理微環(huán)境的響應(yīng)，而共培養(yǎng)細胞的相關(guān)研究很少被報道。乳腺癌是危害女性健康的惡性腫瘤，而SUM159是一種研究三陰性乳腺癌的重要細胞模型[16-17]；同時MCF10A是人類正常乳腺上皮細胞，也是被廣泛用作研究的體外細胞模型[18]。

本文加工了一批深為30 μm、頂部寬度為100 μm、底部寬度遞增(25、50和100 μm)的溝槽結(jié)構(gòu)，研究了2種不同細胞(SUM159和MCF10A)對于這些拓撲結(jié)構(gòu)基底的響應(yīng)。首先，將乳腺癌細胞(SUM159)與正常乳腺上皮細胞(MCF10A)分別接種于微溝槽基底上，研究微溝槽拓撲微環(huán)境對單一細胞的遷移、取向的調(diào)控作用；其次，考慮到在體內(nèi)環(huán)境中是多種細胞緊密接觸，本文將2種細胞在基底上進行共培養(yǎng)，研究在乳腺癌細胞和正常乳腺細胞的混合狀態(tài)下基底接觸引導(dǎo)對其影響。研究發(fā)現(xiàn)，細胞拓撲微環(huán)境可以實現(xiàn)乳腺癌細胞與正常細胞在共培養(yǎng)條件下空間分離。該工作對癌細胞的遷移與空間分離研究具有重要的指導(dǎo)意義。

1 試驗與方法

1.1 基底制備

用于細胞培養(yǎng)的微溝槽基底通過微納米加工工藝制備而成。PDMS基底加工流程示意圖如圖1所示，具體步驟如下：1)通過等離子體增強型化學(xué)氣相沉積(PECVD)在硅片表面沉積一層500 nm厚的二氧化硅；2)旋涂AZ6112光刻膠在氧化硅表面，光刻膠圖形化后，通過反應(yīng)離子刻蝕(RIE)將硅片的二氧化硅圖形化；3)將二氧化硅作為掩模層，利用電感耦合等離子體刻蝕(ICP)對硅基底進行刻蝕，刻蝕深度為30 μm，最終得到底部寬度為100 μm、不同頂部寬度(25、50和100 μm)的硅片模具；4)將上述硅片的微結(jié)構(gòu)通過軟光刻技術(shù)轉(zhuǎn)印到聚二甲基硅氧烷(PDMS)基底，首先將PDMS的預(yù)固化溶液與固化劑以10∶1的比例充分混合，將混合液置于真空腔體中除氣，在混合溶液中的氣體全部去除后將混合液倒在上述硅片模具上，并置于65 ℃烘箱中烘烤4 h。

圖1 PDMS基底加工流程示意圖

為了使細胞能夠更好地粘附在PDMS基底，需要對基底進行功能化處理。首先，氧等離子體處理50 s以產(chǎn)生羥基基團；然后，迅速將基底置于I型膠原蛋白溶液(Sigma Aldrich)中，濃度約為7.5 μg/cm2，室溫孵育1 h。PDMS基底經(jīng)過蒸金后放入電子顯微鏡(ZEISS EVO18)中觀察其微觀結(jié)構(gòu)，掃描電鏡圖如圖2所示。

圖2 掃描電鏡圖

1.2 細胞培養(yǎng)與免疫熒光染色

人類乳腺癌細胞(SUM159)被培養(yǎng)在含有1%的青霉素/鏈霉素、5%的胎牛血清、0.5%的胰島素、0.1%的皮質(zhì)醇和0.008%的慶大霉素的Ham's F-12 Nutrient Mix培養(yǎng)基(總稱培養(yǎng)液)中，人類乳腺上皮細胞(MCF10-A)被培養(yǎng)在含有1%的青霉素/鏈霉素、5%的馬血清、1%的Hepes、0.2%的EGF、0.1%的皮質(zhì)醇、0.1%的霍亂毒素和0.5%的胰島素的DMEM/F-12培養(yǎng)基(總稱培養(yǎng)液)。細胞在CO2濃度為5%，溫度為37 ℃的培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific，美國)中培養(yǎng)。試驗中，功能化的PDMS基底置于35 mm的培養(yǎng)皿中，細胞接種密度為17 500個/cm2。SUM159乳腺癌細胞分別在培養(yǎng)時間為4、24、48和72 h的時間節(jié)點取出，并放置在倒置熒光顯微鏡上進行觀察；MCF10A乳腺上皮細胞分別在4、24、36和48 h培養(yǎng)時間節(jié)點進行光學(xué)顯微鏡觀察。對于共培養(yǎng)試驗，首先在PDMS基底上接種SUM159乳腺癌細胞，而MCF10A乳腺上皮細胞于SUM159細胞接種后24 h進行接種，觀察時間節(jié)點與單一種類細胞培養(yǎng)方式相同。細胞培養(yǎng)48 h后，使用Hoechst 33342 (Invitrogen)對細胞核進行活細胞染色。

1.3 成像與數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有的光學(xué)顯微鏡得到的細胞培養(yǎng)圖像都是由ImageJ及相關(guān)插件(National Institutes of Health, US)進行處理。細胞在溝槽頂/底的數(shù)量分布通過統(tǒng)計方式進行量化。試驗結(jié)果的均值差異的統(tǒng)計顯著性差異通過單邊方差(ANOVA)和Turkey后處理得到。

2 結(jié)果分析

2.1 拓撲微環(huán)境的表征

本文研究了PDMS基底的微米尺度的表面形貌和受限環(huán)境對于細胞分布的影響。基底由標準的軟光刻工藝制備而成。在所有情形下，細胞都是培養(yǎng)在深度為30 μm、頂部寬度為100 μm的PDMS溝槽基底上，底部寬度分別為25、50和100 μm。細胞接種后進行定時觀察，以探究微米尺度受限環(huán)境如何影響細胞分布。在接種完畢的幾分鐘后，由于單個細胞密度大于培養(yǎng)基密度，通過簡單的搖勻，可使細胞絕大部分受限于30 μm的溝槽底部；之后細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按上述給定的時間點觀察，首次觀察定在4 h，主要因為此時細胞與基底形成穩(wěn)定粘附，便于成像。

2.2 拓撲微環(huán)境對SUM159乳腺癌細胞的分布與取向調(diào)控

2.2.1 對細胞的分布進行分析

SUM159乳腺癌細胞在3種不同底部寬度的溝槽基底都表現(xiàn)出明顯的響應(yīng)(見圖3)。圖3中，圖F中標尺同樣適用圖A～圖E。由圖3可以看出，SUM159乳腺癌細胞在培養(yǎng)4 h時間節(jié)點時主要集中在基底底部，然而當培養(yǎng)時間到達72 h后細胞明顯向基底頂部高度聚集，即使基底頂部細胞非常擁擠，基底底部細胞數(shù)量依然很少；同時也發(fā)現(xiàn)，細胞在基底頂部與頂部之間出現(xiàn)了跨橋現(xiàn)象，類似于之前的工作[19-20]。

圖3 SUM159細胞培養(yǎng)在底部寬度為25 μm(A和B)、50 μm(C和D)、100 μm(E和F)的PDMS溝槽基底上

為了對所觀察的現(xiàn)象進行定量化分析，本文通過對溝槽基底頂部和底部細胞數(shù)量的統(tǒng)計，計算了各種幾何尺寸溝槽基底頂部與底部細胞密度(單位面積上細胞數(shù))之比(用R/G表示)，作為隨時間而變化的函數(shù)(見圖4)。圖4中，***表示顯著性差異p<0.005。結(jié)果表明，對于SUM159細胞，經(jīng)過24 h培養(yǎng)，相比于底部寬度為50 μm(R/G=0.26±0.06)和25 μm(R/G=0.49±0.21)的溝槽基底，在底部寬度為100 μm的溝槽基底(R/G=1.17±0.15)往頂部遷移趨勢更強(p<0.005)。當培養(yǎng)時間達到72 h時，SUM159細胞在底部寬度為100 μm的溝槽基底(R/G=1.61±0.09)仍然表現(xiàn)出比底部寬度為50 μm(R/G=1.00±0.06)和25 μm(R/G=0.58±0.13)的溝槽基底更強的往頂部遷移趨勢，其統(tǒng)計顯著性差異p?0.005。

圖4 SUM159細胞在PDMS溝槽基底上的R/G

2.2.2 對細胞的形態(tài)及取向進行分析

本文將細胞長軸方向與垂直于溝槽方向的夾角θ定義為細胞的取向角，當取向角θ接近90°時，說明細胞胞體與溝槽取向一致；當θ接近0°或180°時，說明細胞胞體與溝槽方向垂直。SUM159乳腺癌細胞培養(yǎng)到72 h時，統(tǒng)計分析了上述3種尺寸溝槽基底的頂部細胞胞體取向，以PDMS平面基底上細胞胞體取向作為參照組(見圖5)，由圖5可以看出，相對于其他2種尺寸溝槽基底，底部寬度為25 μm的溝槽基底上的SUM159乳腺癌細胞的胞體更顯著地與溝槽方向一致，而在PDMS平面基底上，SUM159乳腺癌細胞胞體取向均沒有表現(xiàn)出明顯峰值(見圖5中Control線)。

圖5 SUM159細胞在PDMS溝槽基底上胞體關(guān)于溝槽方向的取向分布

2.3 拓撲微環(huán)境對MCF10A乳腺上皮細胞的分布與取向調(diào)控

2.3.1 對細胞的分布進行分析

在相同的拓撲微環(huán)境上，MCF10A細胞的分布與取向結(jié)果與上述SUM159乳腺癌細胞的結(jié)果明顯不同(見圖6)。圖6中，圖F中標尺同樣適用圖A～圖E。在培養(yǎng)4 h后觀察MCF10A細胞主要也是集中在基底底部，然而當培養(yǎng)時間達到48 h，MCF10A細胞仍然大量集中在基底底部，只有非常少部分在基底頂部。很明顯，乳腺癌與正常乳腺上皮細胞對于拓撲微環(huán)境具有截然相反的響應(yīng)。

圖6 MCF10A細胞培養(yǎng)在底部寬度為25 μm(A和B)、50 μm(C和D)、100 μm(E和F)的PDMS溝槽基底上

本文同樣地對微溝槽頂/底的細胞數(shù)量進行統(tǒng)計分析。經(jīng)過48 h培養(yǎng)后，MCF10A細胞在底部寬度為100 μm(R/G=0.09±0.02)、50 μm(R/G=0.05±0.03)和25 μm(R/G=0.02±0.01)的溝槽基底頂部數(shù)量稀少，其大部分都留在基底底部生長。因此，對于微溝槽拓撲基底，MCF10A細胞存在保持在底部生長的趨勢。SUM159細胞在PDMS溝槽基底上頂部與底部細胞密度之比如圖7所示。

圖7 SUM159細胞在PDMS溝槽基底上R/G

2.3.2 對細胞的取向進行分析

本文統(tǒng)計分析了上述3種尺寸溝槽基底的底部細胞胞體取向分布，以PDMS平面基底上細胞胞體取向作為參照組(見圖8)，由圖8可以看出，相對于其他2種尺寸溝槽基底，底部寬度為25 μm的溝槽基底上MCF10A細胞更趨于沿著溝槽方向生長；而在PDMS平面基底上，MCF10A細胞胞體取向均沒有表現(xiàn)出明顯峰值(見圖8中Control線)。

圖8 SUM159細胞在PDMS溝槽基底上胞體關(guān)于溝槽方向的取向分布

2.4 拓撲微環(huán)境對共培養(yǎng)SUM159/MCF10A細胞的分布調(diào)控

為了進一步研究細胞對受限環(huán)境的響應(yīng)，本文將SUM159細胞和MCF10A細胞在上述基底(底部寬度為100 μm)進行共培養(yǎng)(總培養(yǎng)基為各自培養(yǎng)基1∶1配比)72 h，結(jié)果如圖9所示。2種細胞都是通過Hoechst 33342對細胞核進行染色，從而可以更好地識別單個的SUM159細胞或MCF10A細胞。試驗表明，在共培養(yǎng)的條件下，SUM159細胞和MCF10A細胞依然表現(xiàn)出各自單獨培養(yǎng)時的特性。熒光和相差照片顯示，SUM159細胞傾向于溝槽基底頂部，其細胞核之間距離較大(見圖9中圖A和圖B)；MCF10A細胞傾向于溝槽基底底部，其細胞核之間距離更小，胞間連接更緊密(見圖9中圖C和圖D)。同時將2種細胞共培養(yǎng)于PDMS平面基底時，2種細胞處于隨機分布狀態(tài)(見圖9中圖E)。圖9中，圖A和圖B聚焦在溝槽基底頂部，圖C和圖D聚焦在溝槽基底底部；圖A和圖C為熒光模式，圖B和圖D為相差模式；圖D中100 μm標尺同樣適用于圖A～圖C；圖E為SUM159細胞和MCF10A細胞共培養(yǎng)在PDMS平面基底，虛線范圍內(nèi)為單個MCF10A細胞或MCF10A細胞團簇，其余的是SUM159細胞。

圖9 SUM159細胞(A和B)和MCF10A細胞(C和D)在底部寬度為100 μm的PDMS溝槽基底共培養(yǎng)72 h

3 討論

細胞的遷移和取向?qū)τ趥谟虾桶┌Y轉(zhuǎn)移起著非常重要的作用[21-22]。本文研究了SUM159人類乳腺癌細胞和MCF10A人類乳腺上皮細胞在2.5維的微米尺度形貌基底上的空間分布與取向。其中，基底為PDMS溝槽基底，具有固定的深度(30 μm)和頂部寬度(100 μm)，而底部寬度分別為25、50和100 μm。SUM159人類乳腺癌細胞表現(xiàn)出明顯的趨頂性，即向微溝槽的頂部遷移并增殖；而MCF10A人類乳腺上皮細胞則表現(xiàn)出趨底性，即仍在溝槽底部生長并增殖。通過比較溝槽基底頂部和底部細胞密度比，證實了SUM159乳腺癌細胞傾向于往頂部遷移(底部寬度為100、50和25 μm的溝槽基底R/G隨著培養(yǎng)時間增大)，并且底部寬度為100和50 μm的溝槽基底對于引導(dǎo)SUM159細胞往頂部生長趨勢更強(R/G >1)。而MCF10A細胞傾向于在底部生長(R/G?1)，雖然R/G并沒有表現(xiàn)出明顯地隨著培養(yǎng)時間增加而降低，實際由于接種頂部細胞密度過低，R/G起始值很低。

通過試驗分析可知，不同的拓撲微環(huán)境結(jié)構(gòu)參數(shù)對細胞的取向性具有調(diào)控作用。底部寬度為25 μm的溝槽基底對2種細胞取向影響效果更明顯。本文對PDMS溝槽基底使用I型膠原蛋白溶液進行功能化，雖然這種膠原蛋白能夠促進細胞取向、遷移和接觸引導(dǎo)，但是本文使用的是標準的功能化工藝，使膠原蛋白能夠隨機粘附在PDMS基底上，因此可以排除由膠原蛋白引起接觸引導(dǎo)。另外，在PDMS平面基底上，細胞的取向都是隨機的。最后本文將2種細胞在PDMS溝槽基底進行了共培養(yǎng)，同樣2種細胞繼續(xù)保持之前各自的特性，試驗中得到了很好的空間分離效果，而當2種細胞共培養(yǎng)在平面基底時，其分布是隨機的。

大量研究工作已經(jīng)表明細胞行為受到基底形貌的影響，但是細胞對基底形貌產(chǎn)生感知并響應(yīng)的內(nèi)在機理目前還不清楚。由于肌動球蛋白的收縮參與細胞遷移調(diào)控，因此細胞牽引力形成部分感知機制[23-25]。有文獻報道稱纖維細胞也出現(xiàn)類似的趨頂性，其驅(qū)動力來源于溝槽基底頂部與底部的氧氣濃度差[26]，假如乳腺癌細胞和正常乳腺上皮細胞對于氧氣的需求相同，乳腺癌細胞出現(xiàn)了趨頂性，而正常乳腺上皮細胞卻出現(xiàn)了相反的結(jié)果；并且，在試驗過程中，在基底表面有幾毫米厚的液體，在溝槽基底只有30 μm距離的頂部與底部產(chǎn)生氧氣濃度差足以驅(qū)動細胞產(chǎn)生不一致遷移特性的可能性很小，本文認為造成癌細胞與正常細胞空間分離的主要驅(qū)動力為乳腺癌細胞與上皮細胞的細胞功能不同。相對于正常乳腺上皮細胞，乳腺癌細胞能動性更強，其相應(yīng)的腫瘤易轉(zhuǎn)移；因此，往往是細胞的生理功能對感知具有表面形貌特征的微環(huán)境具有決定性作用。

4 結(jié)語

本文研究了2種細胞對PDMS微溝槽基底的響應(yīng)。人類乳腺癌細胞表現(xiàn)出更傾向于在微米尺度的溝槽基底頂部生長，而人類乳腺上皮細胞則是傾向于在基底底部生長，當2種細胞共培養(yǎng)時同樣保持原有的特性。物理受限環(huán)境在引導(dǎo)特定細胞對微米尺度形貌做出響應(yīng)有著很重要的作用，能夠?qū)?種及以上的細胞在三維空間按照特定形式排布也許在細胞分布和增殖機理研究中有著重要意義。由于這2種細胞為研究乳腺癌的重要細胞模型，其遷移特性在癌癥轉(zhuǎn)移方面有潛在應(yīng)用。