張 艷,李 卉,滿成云,魯 婧,于海威

(1.吉林化工學院,化學與制藥工程學院,吉林吉林 132022;2.吉林化工學院研究生院,吉林吉林 132022)

急性肝損傷是一種源于病毒、藥物、毒物等因素導致的急性肝功能障礙。肝損傷是臨床上多種肝病(如肝纖維化、肝炎、肝硬化以及肝癌)共同的病理基礎,嚴重或持續(xù)的損傷最終可導致肝功能衰竭[1-2]。目前對于急性肝損傷的治療多以西藥為主。雖然西藥治療急性肝損傷上取得了一些進展,但仍存在一些不良反應[3-4]。因此,開發(fā)天然可食用的植物有效成分為保肝藥是治療急性肝損傷的新策略。

傳統(tǒng)天然藥物在治療急性肝損傷上有獨特理論與方法,能夠從整體作用角度調(diào)節(jié)人體的機能,然而由于天然藥物成分復雜、作用靶點多樣,致使其作用機制大多不明確,這在一定程度上限制了天然藥物在治療急性肝損傷中的應用[5]。代謝組學是一門新近發(fā)展起來的技術,它是通過考察生物體系受疾病擾動后其代謝產(chǎn)物的變化,研究生物體系代謝途徑的一種技術。其整體性的特點與中醫(yī)理論不謀而合,因此代謝組學可以為天然藥物作用機制研究提供新方法[6]。

平菇(Pleurotusostreatus)又名側(cè)耳、糙皮側(cè)耳,為真菌門擔子菌綱傘菌目口蘑科側(cè)耳屬平菇的子實體,是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的食用菌之一。根據(jù)文獻報道,平菇具有多種藥理活性,如抗腫瘤作用[7-8]、抗氧化作用[9-10]、增強免疫作用[11]、治療阿爾茨海默病作用[12]、降糖降脂作用[13-14]等。多糖是平菇的主要活性成分之一。四氯化碳CCl4是一種肝臟毒性物質(zhì),進入肝細胞后經(jīng)過細胞色素P450酶代謝激活,產(chǎn)生三氯甲基自由基(CCl3·)和過氧化三氯甲基自由基(OOCCl3·),這些自由基與肝細胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體上的磷脂分子發(fā)生共價結(jié)合,引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應損害肝細胞[15]。本文選用CCl4造大鼠急性肝損傷模型。

傳統(tǒng)保肝藥的藥效研究僅進行ALT、AST及ALP等病理生理指標的檢測,只能從宏觀上證明藥物的干預作用,無法全面系統(tǒng)地揭示藥物的作用機制。代謝組學是研究生物體受到外界擾動后內(nèi)源性代謝物的動態(tài)變化,可以從微觀的角度揭示其調(diào)節(jié)生物體各個系統(tǒng)發(fā)揮藥物療效的作用機制。因此,本文借助高通量、高靈敏度、高分辨率的氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用分析手段,利用代謝組學和化學計量學的原理及分析軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理、分析[16-18],考察生物體系病理條件下代謝物的變化及隨時間的變化規(guī)律[19-21],篩選平菇多糖改善急性肝損傷的代謝物(標志物),從代謝變化的角度探尋平菇多糖治療急性肝損傷的作用機制,為開發(fā)平菇多糖為保肝的功能性食品提供前期數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Wistar大鼠 雄性,體重180～220 g,許可證號:SCXK(吉)2016-0001 吉林大學白求恩醫(yī)學院動物實驗中心;N,O-雙三甲硅基三氟乙酰胺(BSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)、脲酶、吡啶、癸酸 分析純,上海麥克林公司;甲醇、CCl4北京化學試劑廠;花生油 市售(魯花牌);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒 深圳雷杜生命科學股份有限公司;平菇多糖 純度45.44%,實驗室自制。

Chemray 24型全自動生化分析儀 深圳雷杜生命科學股份有限公司;GCMS-QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配備EI離子源,AOC-20i自動進樣器) 日本島津公司;HP-5色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25μm) 美國Agilent公司;H2050R型低溫高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 給藥及造模 30只大鼠,適應性飼養(yǎng)一周后,隨機分為3組:空白對照組、模型對照組、平菇多糖組?？瞻讓φ战M和模型對照組分別按10 mL/kg給予水,平菇多糖組每天給予600 mg/kg的平菇多糖溶液,連續(xù)灌胃給藥7 d,末次給藥6 h后,除空白對照組給予生理鹽水2 mL/kg腹腔注射外,模型對照組和平菇多糖組按2 mL/kg腹腔注射50% CCl4花生油一次(v/v),按照文獻方法[15]改良建立急性肝損傷模型。造模后,收集24 h尿液,腹主動脈取血,4 ℃,3000 r/min,離心15 min,分離血清。

1.2.2 血清樣品測試 各組大鼠血清稀釋10倍,按試劑盒方法,全自動生化分析儀測試血清ALT、AST和ALP水平。

1.2.3 尿液前處理 尿樣于12000 r/min離心10 min,取上清液100 μL于1.5 mL離心管中,加入50 μL脲酶水溶液(60 IU/100 μL),混勻后于37 ℃孵育30 min后，加入20 μL癸酸(0.088 g/L)和400 μL甲醇,渦旋混勻1 min,于12000 r/min,4 ℃離心15 min,吸取上清液400 μL于1.5 mL離心管中,真空干燥(4 ℃,10～300 Pa,24 h),后加入50 μL衍生化試劑(V(BSTFA)∶V(TMCS)=99∶1)和50 μL吡啶,于80 ℃水浴反應0.5 h,12000 r/min,4 ℃離心10 min,取上清液,用于GC-MS分析。

1.2.4 GC-MS測試條件 進樣口溫度:280 ℃;分流比:10∶1;載氣:氦氣;流速:1.88 mL/min;柱箱溫度:60 ℃;柱溫程序:起始溫度60 ℃保持3 min后,以6 ℃/min升溫到290 ℃保持10 min;進樣量:0.2 μL,離子源和接口溫度分別為200、230 ℃;電子能量:0.85 eV;溶劑延遲:5.5 min;全掃描模式,掃描范圍m/z:35～600。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

cdf格式的尿樣原始數(shù)據(jù)經(jīng)XCMS Online(https://xcmsonline.scripps.edu/index.php)軟件得到總離子流(Total ion chromatography,TIC)圖,進行峰提取、峰對齊、峰匹配和峰強度校正等操作,將結(jié)果轉(zhuǎn)化為包含化合物保留時間和質(zhì)荷比信息的csv格式文件,并進一步采用Pairwise group分析和Meta group分析進行配對比較和組間比較,篩選可能的標志物。利用NIST(http://webbook.nist.gov/chemistry/)和HMDB(http://www.hmdb.ca/)數(shù)據(jù)庫對篩選的標志物進行鑒定。采用MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca/)軟件進行主成分分析(Principal components analysis,PCA)和代謝通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清ALT、AST和ALP水平

如表1所示,與空白對照組比較,模型對照組大鼠血清中ALT和ALP活性顯著升高(p<0.05),AST活性極顯著升高(p<0.01);與模型對照組比較,平菇多糖組能顯著抑制ALT、AST和ALP活性的升高(p<0.05)。ALT和AST是肝細胞內(nèi)的兩種酶,一旦肝細胞損傷,ALT和AST釋放入血,血液中ALT和AST水平升高。血液中ALT和AST水平異常升高是肝損傷的典型標志[22]。本實驗結(jié)果表明,經(jīng)CCl4造模后,肝細胞膜已被破壞,表現(xiàn)為ALT和AST血清水平升高。經(jīng)平菇多糖治療后,ALT和AST血清水平有所降低。此外,肝細胞損傷同時可引起ALP水平的升高且與損傷程度呈正相關[24]。本研究結(jié)果表明,平菇多糖可明顯降低ALT、AST及ALP水平,表明平菇多糖有明顯的保肝作用,與文獻報道的保肝藥判斷標準一致[22-24]。

表1 平菇多糖對急性肝損傷大鼠血清ALT、AST和ALP水平的影響Table 1 Effect of POP on ALT,AST and ALP in acute liver injury rats

2.2 各組尿液代謝輪廓分析

通過XCMS Online軟件進行尿樣的分離和數(shù)據(jù)采集,得到各組典型TIC圖(圖1)。圖1所示,3組大鼠尿液代謝物有明顯的差異。空白對照組和平菇多糖組的TIC圖基本相似,色譜峰保留時間主要集中在8～35 min,但也有一定區(qū)別,而模型對照組色譜峰相對較少。由PCA圖(圖2)可以看出,空白對照組,模型對照組和平菇多糖組能夠分開并且呈明顯的聚類特征?？瞻讓φ战M樣本主要聚集在得分圖的右側(cè),模型對照組樣本主要聚集在得分圖的左側(cè),給予平菇多糖治療后,樣本點的分布逐漸向模型組右側(cè)移動,表明該組樣本的代謝物有向空白對照組移動的趨勢。

圖1 各組大鼠尿液代謝物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatography of urinary metabolites of three groups注:A：空白對照組;B：模型對照組;C：平菇多糖組。

圖2 各組大鼠的PCA圖Fig.2 Principal components analysis of three groups注:+NG:空白對照組,樣本主要聚集在側(cè)右;△MG:模型對照組,樣本主要聚集在左側(cè);×PG:平菇多糖組,樣本主要聚集中右側(cè),有向空白對照組移動的趨勢。

2.3 標志物的鑒定

利用XCMS online軟件的Pairwise group分析和Meta group分析篩選標志物,p值小于0.05且倍數(shù)變化大于2,可作為標記物的判斷標準,根據(jù)它們分子量,利用NIST數(shù)據(jù)庫和HMDB數(shù)據(jù)庫對標志物進行質(zhì)譜信息匹配,初步鑒定可能標志物。鑒定了5種化合物,分別為檸檬酸、蘋果酸、D-葡萄糖醛酸、十六烷酸和1,2,3-丙烷酸。5種標志物的鑒定結(jié)果如表2所示，標志物在空白對照組、模型對照組和平菇多糖組代謝物譜中的相對含量有明顯的差異。其中與空白對照組比較,模型對照組中檸檬酸、蘋果酸、D-葡萄糖醛酸和1,2,3-丙烷酸含量下降,十六烷酸含量升高(p<0.05),而平菇多糖組中檸檬酸、蘋果酸、D-葡萄糖醛酸和1,2,3-丙烷酸含量較模型組有顯著升高,十六烷酸含量降低(p<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 標志物的鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of biomarkers

2.4 代謝通路分析

利用MetaboAnalyst 3.0軟件對平菇多糖影響急性肝損傷大鼠的標志物進行代謝通路分析。結(jié)果如圖3所示,主要影響3條通路,分別為三羧酸循環(huán)、乙醛酸和二羧酸代謝、抗壞血酸和醛酸代謝。CCl4進入體內(nèi)后,在肝細胞中積累并產(chǎn)生大量自由基,這些自由基與肝細胞中蛋白質(zhì),脂質(zhì)結(jié)合最終導致細胞壞死和脂質(zhì)過氧化等一系列反應,此外,產(chǎn)生的自由基還可直接攻擊肝細胞,導致線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常[25]。線粒體是三羧酸循環(huán)的重要場所,因此,CCl4可直接導致能量代謝異常。檸檬酸和蘋果酸屬于三羧酸循環(huán),平菇多糖可通過上調(diào)檸檬酸和蘋果酸水平,改善三羧酸循環(huán)異常,緩解由于含氧自由基造成的線粒體損傷,維持線粒體的正常生理功能。乙醛酸和二羧酸代謝與體內(nèi)的氧化反應有關,可通過影響三羧酸循環(huán)關鍵酶的活性，導致三羧酸循環(huán)中的各種反應物和產(chǎn)物水平異常[26]。CCl4刺激后的大鼠,大部分的行為活動都出現(xiàn)緩慢、疲乏、不活躍的現(xiàn)象,這可以認為是能量消耗進入一個相對緩慢過程。經(jīng)CCl4刺激后,模型對照組大鼠出現(xiàn)了乙醛酸和二羧酸代謝通路相關的代謝異常。D-葡萄糖醛酸是乙醛酸和二羧酸代謝途徑上的物質(zhì),平菇多糖通過升高D-葡萄糖醛酸水平,調(diào)節(jié)此代謝通路而發(fā)揮保肝作用?？箟难岷腿┧岽x也是和體內(nèi)氧化反應有關的代謝,平菇多糖還可以通過調(diào)節(jié)抗壞血酸和醛酸代謝水平改善機體的氧化損傷,發(fā)揮保肝作用。

圖3 平菇多糖影響大鼠的代謝通路分析Fig.3 Pathway analysis of Pleurotus ostreatus polysaccharide on rats

3 結(jié)論

平菇多糖有明顯的保肝作用,可以顯著降低大鼠急性肝損傷后血清ALT、AST和ALP水平(p<0.05),其治療急性肝損傷的作用機制與擾動體內(nèi)標志物檸檬酸、蘋果酸、D-葡萄糖醛酸、十六烷酸及1,2,3-丙烷酸的水平,調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)、乙醛酸和二羧酸代謝、抗壞血酸和醛酸代謝通路異常有關。平菇作為一種食品,從中提取多糖類成分,安全性高,將其開發(fā)為具有保肝活性的功能性食品具有實際應用價值。