鄧 風，王玉榮，尚雪嬌，折米娜，葛東穎，趙慧君，郭 壯,2,*

（1.湖北文理學院食品科學技術學院，鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.恩施市公共檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000）

中式臘腸起源于南北朝前期，是一種外形美觀、味道鮮醇、營養(yǎng)豐富的傳統(tǒng)風味肉制品[1]。傳統(tǒng)中式臘腸多采用自然發(fā)酵的方式制作，而被稱為“世界硒都”的恩施土家苗族自治州境內(nèi)以山地為主體，少數(shù)民族文化多樣，較好地保留了這種傳統(tǒng)臘腸制作工藝[2]。恩施地區(qū)生產(chǎn)的臘腸以豬肉為原料，添加食鹽、白酒、八角茴香和花椒等輔料，用松柏木熏制或自然晾曬而成。由于制作環(huán)境相對開放，臘腸樣品中含有豐富的微生物群系。劉長建等[3]從臘腸中分離出35 株具有降膽固醇能力的乳酸菌，通過對比發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）清除膽固醇的效率最高。謝科等[4]采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法從廣式臘腸中分離出4 株葡萄球菌（Staphylococcus），使用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）技術分析發(fā)現(xiàn)，腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）為其中主要的優(yōu)勢細菌。Wang Xinhui等[5]采用高通量測序技術對中式干臘腸、中式熏臘腸和香腸中的細菌群落結構差異進行分析，發(fā)現(xiàn)中式干臘腸、中式熏臘腸中的細菌分布比香腸更為豐富。然而，目前多數(shù)研究主要圍繞廣式臘腸展開，有關恩施地區(qū)臘腸微生物多樣性的研究仍較少。

大量研究表明，紅曲菌[6]、戊糖乳桿菌[7-8]和葡萄球菌[9-10]對臘腸品質的形成具有明顯影響，因而廣泛開展微生物多樣性的解析對臘腸品質的提升具有積極意義。PCR-DGGE[11]和MiSeq高通量測序技術[12]是在發(fā)酵食品微生物多樣性解析中運用較多的2 項技術，其中PCR-DGGE具有操作簡單易行、靈敏度高和可檢測到1 個核苷酸水平差異的特點[13]，而MiSeq高通量測序技術實現(xiàn)了多樣本間微生物多樣性的平行比較，具有通量高的優(yōu)點[14]，目前將2 項技術相結合在窖泥[15]、泡菜[16]和豆豉[17]等發(fā)酵食品微生物多樣性解析中得到了廣泛應用。

本研究采用PCR-DGGE與MiSeq高通量測序技術相結合的方法對采集自恩施市的臘腸樣品的細菌多樣性進行解析，在明確微生物群落結構構成的基礎上，為該地區(qū)后續(xù)臘腸品質的提升提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

聚丙烯酰胺、冰醋酸、飽和酚、尿素、過硫酸銨、四甲基乙二胺、硝酸銀、甲醛、乙二胺四乙酸二鈉、N,N-亞甲基二丙烯酰胺和氯仿 國藥集團化學試劑有限公司；QIAGEN DNeasy Mericon Food Kit提取試劑盒德國Qiagen公司；Axygen清潔試劑盒 北京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；SolutionⅠ、6×Loading Buffer、DNA聚合酶、dNTP mix、pMD18-T Vector和10×PCR Buffer 寶生物工程（大連）有限公司；引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設備

HBM-400B拍擊式無菌均質器 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；DCodeTMSystem 美國Bio-Rad公司；VeritiTM96 孔梯度PCR擴增儀 美國AB公司；5810R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；ND-2000C微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司；Bio-5000 plus掃描儀 上海中晶科技有限公司；MiSeq PE300高通量測序平臺 美國Illumina公司；R920機架式服務器美國Dell公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

分別從湖北省恩施市土橋壩和舞陽壩體育場菜市場（（109.47 °N，30.3 °E））采集臘腸樣品5 種，編號為LC1～LC5。采集的臘腸樣品應符合以下標準：1）臘腸使用豬肉制作而成；2）臘腸無肉眼可見雜質、無霉變且無異味；3）臘腸的制作地需在恩施市行政區(qū)域內(nèi)。

1.3.2 樣品預處理及微生物宏基因組DNA提取

將臘腸切碎后，取10 g加入90 mL生理鹽水，使用拍擊器拍擊3 min后，300 r/min條件下離心10 min取上清，上清液10 000 r/min條件下離心10 min后取沉淀，使用QIAGEN DNeasy Mericon Food Kit進行微生物宏基因組DNA提取。

1.3.3 基于DGGE技術的臘腸細菌多樣性評價

用滅菌雙蒸水將各樣品宏基因組DNA的質量濃度調至30 ng/μL，用于后續(xù)擴增PCR的擴增體系為25 μL，正向和反向引物分別為LacF-GC-V3F（5’-CG CCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGCCCGGGGGCAC CGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和Lac-V3R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）。擴增條件和程序：參照文獻[18-19]中的方法，對16S rRNA的V3區(qū)進行擴增。擴增結束后用1%的瓊脂糖凝膠電泳（2 000 bp的Maker為參照，電壓120 V，恒壓時間30 min）檢測是否擴增出單一、明亮的目的條帶[20]。

使用8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性范圍為35%～52%，將0.5×TAE緩沖溶液的溫度調至60 ℃，每個膠孔加入10 μL擴增產(chǎn)物，120 V預電泳78 min，然后80 V固定電壓下電泳13 h。電泳結束后的凝膠采用銀染法顯色，并置于掃描儀上成像[21]。用無菌手術刀回收優(yōu)勢條帶，加無菌超純水過夜，取回溶溶液2 μL進行PCR擴增，擴增使用不帶GC夾子的正反引物各0.5 μL以及12.5 μL 2×PCR mix，用無菌超純水補齊至20 μL[21]，擴增程序參照文獻[18-19]中的方法。將重新擴增的PCR產(chǎn)物用清潔試劑盒清潔后連接至PMD18-T載體上，然后導入大腸桿菌Top10，將篩選出的陽性克隆送至測序公司測序[22]。

1.3.4 基于MiSeq高通量測序技術的臘腸細菌多樣性評價

對樣品微生物宏基因組16S rRNA的V3-V4區(qū)進行擴增，引物為338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGT-3’），擴增時在引物的5’端加上核酸標簽[23]，擴增體系和條件參照蔡麗云等[24]的方法。擴增產(chǎn)物檢測合格后寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序，測序平臺為Illumian MiSeq PE300。

將測序數(shù)據(jù)上傳至R920機架式服務器端，利用QIIME分析平臺[25-26]進行序列分析。原始數(shù)據(jù)去除低質量序列后采用兩步Uclust法[27]在97%的相似度下劃分分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）；從每個OTU中挑選代表性序列與RDP（ribosomal database project，Release 11.5）[28]和Greengenes（Release 13.8）[29]數(shù)據(jù)庫進行比對后，使用FastTree軟件[30]構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并計算α多樣性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用多元統(tǒng)計學手段對微生物各分類地位的種類、數(shù)量、相對含量及α多樣性指數(shù)進行計算；序列長度分布圖、OTU出現(xiàn)頻率和包含序列數(shù)統(tǒng)計圖以及臘腸中優(yōu)勢核心OTU相對含量的比較分析圖用Origin 2017軟件繪制；臘腸中優(yōu)勢細菌門屬相對含量的比較分析圖和臘腸中優(yōu)勢核心OTU相對含量的比較分析圖用Excel 2016軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 基于DGGE技術的臘腸細菌多樣性

圖 1 臘腸中細菌的DGGE圖譜Fig. 1 DGGE fi ngerprint of bacteria in sausage samples

由圖1可知，條帶6和條帶7的亮度遠高于其他5 個條帶且在每個樣品中均存在，說明條帶6和條帶7所代表的細菌可能為臘腸樣品中的優(yōu)勢菌屬。條帶1～5亮度偏暗，且其僅在某幾個臘腸樣品中存在，說明這些條帶代表的菌屬在臘腸中的含量偏低，且可能僅存在于部分樣品中。樣品LC1的條帶數(shù)最多，而樣品LC5最少，說明樣品LC1的細菌多樣性最高，樣品LC5最低。

表 1 細菌DGGE條帶測序結果Table 1 Sequencing of bacterial DGGE bands

由表1可知，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，臘腸樣品中的細菌由Anaerostipes hadrus、約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）、Vibrio litoralis、馬胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）、熱死環(huán)絲菌（Brochothrix thermosphacta）和未知分類地位的不可培養(yǎng)細菌構成，且環(huán)絲菌屬為其優(yōu)勢細菌屬。

2.2 基于MiSeq高通量測序技術的臘腸細菌多樣性

較之PCR-DGGE技術，以MiSeq為代表的第2代高通量測序技術具有通量高的優(yōu)點，且實現(xiàn)了菌群的相對定量分析，因而本研究進一步采用MiSeq高通量測序技術對5 個臘腸樣品的細菌多樣性進行解析，同時對PCR-DGGE的結果進行驗證。

通過MiSeq高通量測序，本研究5 個臘腸樣品共產(chǎn)生193 486 條高質量的16S rDNA序列，平均每個臘腸樣品產(chǎn)生38 697 條，切除引物和Barcode后序列長度的分布情況如圖2所示。

圖 2 序列長度分布圖Fig. 2 Distribution of sequence length

由圖2可知：193 486 條高質量的16S rDNA序列中有175 308 條集中在440～459 bp，占到序列總數(shù)的90.61%；18 069 條集中在420～439 bp，占到序列總數(shù)的9.34%。使用QIIME平臺，對高質量序列進行生物信息學分析，結果表明，共有193 356 條序列通過Align（對齊），按照100%相似性進行Uculst劃分后共得到84 979 條代表性序列，按照97%相似性進行Uculst劃分后共得到8 057 個OTU，且沒有發(fā)現(xiàn)嵌合體。

圖 3 OTU出現(xiàn)頻率和包含序列數(shù)統(tǒng)計Fig. 3 Occurrence frequency of OTU and number of sequences within OTU

本研究進一步對OTU在5 個樣品中出現(xiàn)的頻率和包含序列數(shù)進行統(tǒng)計。由圖3可知，在5 個樣品中出現(xiàn)1、2、3、4 次的OTU分別有6 742、771、289、142 個，分別占OTU總數(shù)的83.68%、9.57%、3.59%和1.76%，其包含的序列數(shù)分別為18 341、11 093、7 039、19 140 條，分別占所有質控后合格序列數(shù)的10.21%、5.76%、3.88%和10.13%。雖然核心OTU僅有113 個，僅占OTU總數(shù)的1.40%，但其包含的序列數(shù)為137 743 條，占所有質控后合格序列數(shù)的70.02%。由此可見，5 個臘腸樣品共有大量的細菌類群。

表 2 樣品測序結果及各分類地位數(shù)量Table 2 Read counts and number of identif i able units at different taxonomical levels

使用RDP和Greengenes數(shù)據(jù)庫比對后，所有序列鑒定為14 個門、58 個綱、90 個目、110 個科和261 個屬。由表2可知，樣品LC1的超Ⅰ指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)值均最大，而樣品LC5的2 個值均最小，說明樣品LC1的細菌多樣性最高，而樣品LC5最低，與PCR-DGGE結果一致。

圖 4 臘腸中優(yōu)勢細菌門相對含量的比較分析Fig. 4 Comparative analysis of the content of the dominant bacterial phyla in sausage samples

進一步在門水平上對臘腸樣品的細菌多樣性進行解析。由圖4可知，臘腸樣品中平均相對含量大于1.0%的細菌門分別為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍細菌（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria），其平均相對含量分別為57.01%、30.43%、7.67%、2.63%和2.01%。此外，另有序列被鑒定為TM7、酸桿菌門（Acidobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、綠彎菌門（Chlorof l exi）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、螺旋體（Spirochaetes）和柔膜菌門（Tenericutes），但其累計平均含量僅為0.13%。由此可見，臘腸樣品中的細菌主要隸屬于硬壁菌門和變形菌門，其比例占到細菌總數(shù)的87.44%。

經(jīng)RDP和Greengenes數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，有13.72%的序列無法鑒定到屬水平，相對含量大于1.0%的細菌屬如圖5所示。

圖 5 臘腸中優(yōu)勢細菌屬相對含量的比較分析Fig. 5 Comparative analysis of the contents of the dominant bacterial genera in sausage samples

由圖5可知，臘腸樣品中共有11 個細菌屬的平均相對含量大于1.0%，其中環(huán)絲菌屬（Brochothrix）、葡萄球菌（Staphylococcus）、乳酸桿菌（Lactobacillus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）4 個屬隸屬于硬壁菌門，其平均相對含量分別為38.34%、9.79%、2.80%和2.29%。嗜冷桿菌（Psychrobacter）、發(fā)光桿菌（Photobacterium）、綠膿桿菌（Pseudomonas）、不動細菌屬（Acinetobacter）、弧菌（Vibrio）、泛菌屬（Pantoea）和克雷伯氏菌（Klebsiella）7 個屬隸屬于變形菌門，其平均相對含量分別為7.55%、5.90%、4.82%、2.19%、1.69%、1.48%和1.33%。由此可見，臘腸樣品中含量最多的細菌為環(huán)絲菌屬，與DGGE結果一致。環(huán)絲菌屬為兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌，是導致豬肉在低溫冷藏條件下污染的主要細菌之一[31]。此外，葡萄球菌、綠膿桿菌和克雷伯氏菌亦可對食品造成污染[32]。因此，接種乳酸桿菌和明串珠菌屬進行臘腸的純種發(fā)酵，在保持臘腸加工和貯藏環(huán)境清潔的同時，對提升臘腸相關產(chǎn)品的安全品質可能具有積極意義[7]。

圖 6 臘腸中優(yōu)勢核心OTU相對含量的比較分析Fig. 6 Comparative analysis of the contents of the dominant core OTUs in sausage samples

對142 個相對含量大于1.0%的核心OTU進行統(tǒng)計和分析。由圖6可知，臘腸樣品中OTU 6108（隸屬于Brochothrix）、OTU 4346（隸屬于Psychrobacter）、OTU 4525（隸屬于Staphylococcus）、OTU 1679（隸屬于Lactobacillus）、OTU 1064（隸屬于Vibrio）和OTU 7759（隸屬于Staphylococcus）的平均相對含量分別為36.19%、4.28%、3.35%、2.42%、1.50%和1.49%，均大于1.0%。由此可見，5 個臘腸樣品共有大量的細菌類群，6 個核心OTU占到了序列總數(shù)的49.23%。

3 結 論

MiSeq高通量測序結果表明：恩施地區(qū)臘腸樣品中的細菌主要隸屬于硬壁菌門和變形菌門，二者比例占到細菌總數(shù)的87.44%；113 個核心OTU中的序列占所有質控后合格序列數(shù)的70.02%，說明5 個臘腸樣品共有大量的細菌類群。PCR-DGGE與Illumina MiSeq 檢測結果均表明恩施臘腸中優(yōu)勢細菌屬為環(huán)絲菌屬。