駱 勇 ，何燕玲 ，姚成芬 ，馬 雪 ，楊 暢 ，譚安菊 3，，李勇軍 △

（1．貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 貴陽 550004； 2．貴州醫(yī)科大學(xué)·民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004； 3．貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004； 4．貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004）

云實(shí)皮為豆科植物云實(shí)Caesalpinia decapetala（Roxb．）Alston 的干燥根或根皮，俗名閻王刺（貴州）、雷公刺、刺木草等，分布于我國貴州、廣東、海南等地［1-2］。其收載于2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，為貴州省民間常用藥材，民間使用較廣泛，苗藥“云實(shí)感冒合劑”“馬蘭感寒膠囊”等均含有該藥材。其具有祛風(fēng)除濕、解毒消腫的功效，可用于治療感冒發(fā)熱、咳嗽、咽喉腫痛、牙痛等癥［3］。云實(shí)主要含萜類和黃酮類化學(xué)成分，有良好的抗瘧疾活性及抗病毒等生物活性［4-7］。前期研究對(duì)云實(shí)皮抗炎作用活性部位的化學(xué)成分進(jìn)行了研究［8］，并選用活性部位含量較高且具有代表性和專屬性的二氫紅花菜豆酸苷和（±）原蘇木素B為對(duì)照品，對(duì)云實(shí)皮藥材進(jìn)行了含量測(cè)定［9］。為從整體上控制藥材的質(zhì)量和確保藥材的一致性，在前期研究基礎(chǔ)上，本研究中建立了云實(shí)皮藥材的指紋圖譜測(cè)定方法，確定了14個(gè)共有峰，并鑒定了其中2個(gè)峰，為進(jìn)一步提高云實(shí)皮藥材的質(zhì)量控制提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀（包括二元梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、Empower 2工作站）；AE240型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司）；TDL80-2B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；超純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）。

1．2 試藥

（±）原蘇木素B對(duì)照品，二氫紅花菜豆酸苷對(duì)照品（本實(shí)驗(yàn)室自制并鑒定，HPLC面積歸一化法計(jì)算，純度＞98%）；乙腈和甲酸為色譜純，甲醇為分析純，水為純凈水。32批云實(shí)皮藥材采收于貴州省各地（見表1），由貴州醫(yī)科大學(xué)藥用植物與生藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為豆科植物云實(shí)Caesalpinia decapetala（Roxb．）Alston的干燥根莖。

表1 32批云實(shí)皮樣品來源

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：AcquityUPLCBEHC18柱（150mm×2．1mm，1．7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0．1% 甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～12 min，5%A；12～30 min，5% ～14%A；30～32 min，14% ～20%A）；流速：0．3 mL ／min；柱溫：45 ℃；檢測(cè)波長：266 nm；進(jìn)樣量：1 μL。

2．2 溶液制備

對(duì)照品溶液：分別稱?。ā溃┰K木素B、二氫紅花菜豆酸苷適量，精密稱定，用50%甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為 2．400 mg／mL 和 0．796 mg／mL 的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：稱取云實(shí)皮粉末（過40目篩）約2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取2 h，置室溫，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，以10 000 r／min的速率離心10 min，取上清液，即得。

2．3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取同一批云實(shí)皮樣品，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2．1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，采用國家藥典委員會(huì)的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004年A版）”計(jì)算相似度。結(jié)果均大于0．99，表明儀器精密度良好。

圖1 32批云實(shí)皮超高效液相色譜指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批云實(shí)皮樣品，依法平行制備供試品溶液6份，依法測(cè)定，記錄色譜圖，同法計(jì)算相似度。結(jié)果均大于0．99，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批云實(shí)皮樣品，依法制備供試品溶液，分別于 2，4，8，12，24 h 時(shí)按相同色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，同法計(jì)算相似度。結(jié)果均大于0．99，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．4 指紋圖譜的建立及相似度計(jì)算

2．4．1 指紋圖譜的建立

取32批云實(shí)皮藥材，依法分別制備供試品溶液，以相同色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，依法評(píng)價(jià)相似度，利用中位數(shù)法進(jìn)行自動(dòng)匹配生成對(duì)照?qǐng)D譜R。詳見圖1。

2．4．2 指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)

采用同一系統(tǒng)分析了32批不同產(chǎn)地云實(shí)皮藥材的指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表2?？梢?，指紋圖譜相似度除貴陽藥用植物園2批藥材（編號(hào)為S1 和 S3）低于 0．5，貴州從江 1 批藥材（編號(hào)為 S30）低于0．8外，其余批次均在0．860～1．000之間，說明貴州產(chǎn)云實(shí)皮藥材含有的化學(xué)成分較一致。

表2 32批藥材指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2．4．3 共有峰的指認(rèn)

通過比較32批云實(shí)皮藥材的指紋圖譜，確定了14個(gè)共有峰。通過與混合對(duì)照品溶液色譜圖的比對(duì)，指認(rèn)出2個(gè)峰，其中9號(hào)峰為二氫紅花菜豆酸苷，10號(hào)峰為（±）原蘇木素B。詳見圖2。

3 討論

圖2 云實(shí)皮指紋圖譜

本試驗(yàn)中測(cè)定了貴州32批云實(shí)皮藥材的UPLC指紋圖譜，確定了14個(gè)共有峰，并通過對(duì)照品指認(rèn)了二氫紅花菜豆酸苷和（±）原蘇木素B 2個(gè)主要特征峰?？傮w來看，各批藥材整體峰形相似，而峰面積存在一定差異。除貴陽藥用植物園2批和從江1批藥材相似度小于0．800外，其余指紋圖譜的相似度均較高，說明貴州不同產(chǎn)地云實(shí)皮藥材整體化學(xué)成分組成差異較小，含量有一定差異，這與云實(shí)的生長環(huán)境、采收時(shí)間，云實(shí)皮的加工處理及貯藏方法有關(guān)。方法學(xué)考察結(jié)果表明，本試驗(yàn)中建立的UPLC法操作簡便，所建立的指紋圖譜峰分離度、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均好，可用于控制云實(shí)皮藥材的質(zhì)量一致性。