高 翔 ，馬鵬飛 ，崔亞寧 ，唐 娜 △，馬 麗

（1．陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710065； 2．陜西省咸陽市中心醫(yī)院藥學(xué)部，陜西 咸陽 712000）

維生素是維持人體正常生命代謝和某些特殊生理功能不可缺少的低分子有機(jī)化合物［1］。各種維生素均必須達(dá)到一定的攝入量才能維持機(jī)體的正常生理機(jī)能，攝入過多或過少均會引起生理疾?。?］。維生素CE咀嚼片是以維生素C和維生素E為主要原料制成的保健食品，用于補(bǔ)充維生素C和維生素E。保健食品可調(diào)節(jié)機(jī)體功能，但不以治療疾病為目的，為了更好地控制其質(zhì)量，應(yīng)評價其致突變性［3］。本研究中以小鼠精子畸形率和骨髓細(xì)胞微核率為指標(biāo)，對維生素CE咀嚼片進(jìn)行了安全性評價?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1．1 儀器與試藥

BS2202S型電子天平（賽多利斯公司）；BX43F型電子顯微鏡（奧林巴斯公司）；解剖器材，細(xì)胞計數(shù)器。環(huán)磷酰胺（Sigma公司，批號為SLBG4216V）；伊紅染料（批號為 20110809），甲醇（分析純，批號為 20131206），Giemsa色素（批號為20140616），均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號為131103）；中研通牌維生素CE咀嚼片（陜西仁康藥業(yè)有限公司，批號為121002）。

1．2 試驗動物

SPF級雄性BALB／c種小鼠25只，體質(zhì)量25～30 g，用于小鼠精子畸形試驗；BALB／c種小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，用于骨髓細(xì)胞微核試驗。動物均由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK（陜）2014-002。動物室溫度 22～26℃，相對濕度40%～70%。實驗動物使用許可證號為 SYXK（陜）2013-001。

1．3 方法

小鼠精子畸形試驗［4-5］：將25只雄性小鼠隨機(jī)分為5組，各5只。本實驗室測得維生素CE咀嚼片的半數(shù)致死量（LD50）為 3．2 g ／kg。按照LD50的 1 ／2，1 ／4，1 ／8 試驗，分為高（1．6 g／kg）、中（0．8 g／kg）、低（0．4g ／kg）3個劑量組，另設(shè)陰性對照組（采用蒸餾水灌胃）和陽性對照組（采用環(huán)磷酰胺40 mg／kg灌胃）。各組動物灌胃體積為20 mL／kg，每日經(jīng)口灌胃1次，連續(xù)灌胃5 d，于首次給受試物后第35天頸椎脫臼處死，取兩側(cè)副睪，放入盛有1．5 mL生理鹽水的平皿中，用眼科剪將副睪縱向剪1～2刀，靜置3～5 min，用4層擦鏡紙過濾，吸濾液涂片，空氣干燥后，用甲醇固定10 min，1%伊紅染色1 h后，用水輕沖，干燥。在高倍鏡下每只動物計數(shù)1 000條完整精子，記錄精子畸形類型（無鉤、香蕉形、無定型、胖頭、尾折疊、雙頭、雙尾等）、畸形數(shù)，并計算畸形率［6］。

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗［7］：將50只小鼠（雌雄各半）隨機(jī)分為5組，各10只，分組及劑量同小鼠精子畸形試驗。經(jīng)口連續(xù)灌胃2 d，第2天給受試物后6 h頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠股骨骨髓，常規(guī)涂片，自然干燥后，放入甲醇中固定10 min，將固定好的涂片在Giemsa應(yīng)用液中染色10 min，立即用蒸餾水沖洗，晾干。在油鏡下觀察，每只動物計數(shù)1 000個嗜多染紅細(xì)胞，分別計算雌、雄小鼠各試驗組的嗜多染紅細(xì)胞與正染紅細(xì)胞（PCE／RBC）比值和嗜多染紅細(xì)胞（PCE）微核率。微核檢出率以千分率表示［8-9］。

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19．0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料精子畸形采用Wilcoson秩和檢驗，骨髓細(xì)胞微核采用 χ2檢驗，按動物性別分別統(tǒng)計。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果見表1和表2、圖1和圖2。

3 討論

正常情況下，人或其他哺乳動物的精液中存在少量畸形精子，正常小鼠的精子畸變范圍一般為0．8%～3．4%，不同品系小鼠的精子畸形率基礎(chǔ)值差異較大。林建等［10］的研究表明，美國癌癥研究所（ICR）小鼠更適合作為小鼠精子畸形試驗的材料。但目前研究少見有統(tǒng)計BALB／c小鼠的基礎(chǔ)值。本試驗條件下，BALB／c小鼠的精子畸形率低至2．28%，表明維生素CE咀嚼片對小鼠精子畸形無影響。

表1 小鼠精子畸形試驗結(jié)果（n＝5）

表2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗結(jié)果（n＝10）

圖1 小鼠精子畸形類型（1%伊紅染色，1 000倍）

圖2 小鼠骨髓細(xì)胞微核形成（Giemsa應(yīng)用液染色，1 000倍）

微核的形成是細(xì)胞受遺傳毒性物質(zhì)作用后的遺傳學(xué)終點［11］，因此廣泛用于檢測新藥、食品和化妝品等是否具有誘導(dǎo)染色體或有絲分裂器損傷的作用［12］。由骨髓細(xì)胞微核試驗結(jié)果可知，受試物同一劑量組內(nèi)雌、雄小鼠之間微核無明顯的性別差異，且受試物各劑量組雌、雄小鼠微核率與陰性對照組比較，均無顯著性差異，而與陽性對照組比較差異極顯著，表明在本試驗條件下，維生素CE咀嚼片對小鼠骨髓細(xì)胞微核無明顯影響。

由于人們生活水平的提高及保健意識的增強(qiáng)，通過服用保健食品來預(yù)防疾病逐漸興起。作為廣泛應(yīng)用的可增強(qiáng)免疫力的保健食品，維生素CE咀嚼片在本試驗劑量下對小鼠精子畸形率和骨髓細(xì)胞微核率無明顯影響，對小鼠生殖細(xì)胞和體細(xì)胞均無致遺傳毒性作用。