孫歡歡，卿太平，步鴻昌，何曉曉*，王柯敏,2*

(1.湖南大學 生物學院，湖南 長沙 410082；2.湖南大學 化學化工學院，湖南省生物納米與分子工程重點實驗室，湖南 長沙 410082)

熒光金屬納米簇(Metal nanoclusters)是一類由幾個至數(shù)百個金屬原子堆積而成的納米材料，處于單個金屬原子和較大的金屬納米顆粒之間的過渡狀態(tài)[1]。金屬納米簇的尺寸接近費米波長(< 2 nm)，與較大的納米顆粒相比，具有更為獨特的物理化學性質(zhì)，因而表現(xiàn)出優(yōu)異的光學特性，如熒光發(fā)射可調(diào)、斯托克斯位移大、熒光穩(wěn)定性高、量子產(chǎn)率較高等[2-3]。熒光金屬納米簇的合成一般采用模板法，以生物分子(蛋白質(zhì)、DNA、氨基酸和多肽等)作為合成的配體，金屬離子在還原劑的作用下被還原成原子團簇。與傳統(tǒng)的熒光染料和量子點相比，熒光金屬納米簇的毒性大大降低，生物相容性顯著提高。因此，它們作為一種新型的納米熒光探針，在生化分析、環(huán)境檢測、醫(yī)學成像和腫瘤治療等領(lǐng)域得到了廣泛應用[4-8]。

目前，有關(guān)金屬納米簇的綜述已有不少報道[9-13]，但大多側(cè)重于金屬納米簇的生化應用研究進展，或僅圍繞一種金屬納米簇展開論述。本文將對各種金屬納米簇的合成與性質(zhì)進行概述，進而對其在生物醫(yī)學領(lǐng)域包括生物傳感、生物成像及腫瘤治療中的應用進行闡述，并對金屬納米簇在生物醫(yī)學領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)和發(fā)展機遇進行了探討。

1 熒光金屬納米簇的合成

熒光金屬納米簇的合成根據(jù)路徑可分為“自下而上”和“自上而下”兩種方法，如圖1所示[14]。前者使金屬離子(Mn+)在還原劑存在下被還原為零價金屬(M)，零價金屬再在配體分子上成核生長為納米簇。目前常用的配體分子有脫氧核酸(DNA)、多肽、蛋白質(zhì)、巰基小分子或聚合物等?！白陨隙隆狈ㄊ峭ㄟ^配體對大尺寸納米粒子的刻蝕作用進而獲得小尺寸的納米簇，按還原方法不同又可分為化學還原法、光還原法、超聲還原法、微波還原法和電化學還原法等。為獲得性質(zhì)優(yōu)良的金屬納米簇，上述方法通常需考慮以下因素：(1)配體與金屬原子間較強的相互作用力；(2)適宜的還原條件；(3)足夠的老化時間。以下針對不同金屬納米簇的特點，分別對其常用的合成方法進行了介紹。

圖1 金屬納米簇的不同制備方法[14]
Fig.1 Various routes for the synthesis of metal nanoclusters[14]

圖2 BSA-Au NCs的“綠色”合成方法[19]Fig.2 Green synthesis of BSA-Au NCs [19]

1.1 熒光金納米簇的合成

熒光金納米簇(Au NCs)是金屬納米簇中穩(wěn)定性最好的納米材料之一，相關(guān)研究開展最早。通常利用HAuCl4作為金屬前驅(qū)體，由于Au原子與S原子之間存在較強的共價結(jié)合力，因此一般選擇含巰基的生物分子作為配體，在適當?shù)倪€原條件下一步合成具有熒光發(fā)射的Au NCs[15-17]。該方法一方面利于簇的形成，獲得光學性質(zhì)優(yōu)良的Au NCs；另一方面可降低材料的毒性，使Au NCs具有良好的生物學應用價值。Negishi等[18]利用谷胱甘肽(GSH)作為配體，在NaBH4還原下合成了含不同Au原子個數(shù)的Au NCs，結(jié)果表明其光學性質(zhì)普遍具有配體濃度和金核原子個數(shù)依賴性；Xie等[19]利用牛血清蛋白(BSA)為配體和還原劑發(fā)展了一種“綠色”方法制備了量子產(chǎn)率為6%的Au NCs，它在一定激發(fā)光照射下發(fā)出紅色熒光(圖2)。采用相似的化學還原方法，以胃蛋白酶[20]、乳鐵蛋白[21]、胰蛋白酶[22]、溶菌酶[23]和木瓜蛋白酶[24]等蛋白質(zhì)為配體的Au NCs也相繼被合成。另外，還可通過“自上而下”法即利用含巰基的配體對尺寸較大的金納米顆粒(Au NPs)進行刻蝕作用合成Au NCs?？涛g途徑分為配體誘導的刻蝕和對金屬核的直接刻蝕兩種途徑。前者是利用過量的配體對Au NPs表面的Au原子進行“剝離”，形成配體-Au+復合物，復合物之間再通過親金作用(Au+- Au+)相互結(jié)合形成Au NCs[25]；后者是利用過量配體對Au NPs的金核直接進行刻蝕，使其粒徑逐漸減少，形成具有熒光發(fā)射的Au NCs[26]。

除了上述以Au—S的共價結(jié)合作用制備Au NCs外，樹枝狀的大分子內(nèi)部空腔中豐富的表面官能團也可以絡(luò)合Au3+形成復合物用于Au NCs的制備。利用聚酰胺-胺型樹枝狀高分子(PAMAM)為配體，Bao等[27]發(fā)展了兩種制備Au NCs的方法：一種是在生理溫度下緩慢合成具有綠色熒光發(fā)射的Au NCs；另一種是以抗壞血酸為還原劑，通過緩慢還原Au3+合成具有多種熒光發(fā)射的Au NCs。為縮短合成時間，Jao等[28]發(fā)展了微波還原法用于PAMAM-Au NCs的快速合成，合成時間由4 d縮短至0.5 h；Liu等[29]利用超聲還原法制備了近紅外發(fā)射的BSA-Au NCs；Zhang等[30]利用光還原法制備了以巰基化的聚合物為配體的Au NCs。這3種物理還原方法均不需其他還原劑的參與，制備過程簡易并提高了量子產(chǎn)率。研究表明，Au還能與含氮堿基腺嘌呤和胞嘧啶相互作用而結(jié)合[31]，因此DNA也能作為配體合成Au NCs[32-33]。

1.2 熒光銀納米簇的合成

與金納米簇類似，Ag原子與S原子之間也存在較強的共價結(jié)合力。因此，含巰基的化合物亦可作為配體合成銀納米簇(Ag NCs)。Adhikari等[34]以二氫硫辛酸(DPA)為配體，利用NaBH4還原Ag+，合成了具有近紅外熒光發(fā)射的Ag NCs，該Ag NCs的斯托克斯位移大于200 nm，具有應用于細胞成像的潛力。在此基礎(chǔ)上，Yuan等[35]發(fā)展了以巰基化合物為配體的反向轉(zhuǎn)移法，即在水相中經(jīng)化學還原后，再將體系轉(zhuǎn)移至乙醇中進行緩慢刻蝕，所合成的Ag NCs具有更好的分散性，超高的穩(wěn)定性和超小的尺寸。Zhu等[36]用該方法合成了具有藍色和紅色雙發(fā)射熒光的GSH-Ag NCs，合成過程中GSH和Ag+的濃度比值發(fā)生改變，雙發(fā)射峰的熒光強度也隨之改變。

PAMAM等聚合物由于帶大量的官能團也可作為合成Ag NCs的一類配體。Zheng等[37]在該方面做了開創(chuàng)性的研究，首次以羥基封端的PAMAM為配體合成了穩(wěn)定的Ag NCs。Yuan等[38]以超支化聚乙烯亞胺(hPEI)為配體，抗壞血酸為還原劑合成了藍綠色熒光發(fā)射的hPEI-Ag NCs，該納米簇具有很好的pH值穩(wěn)定性，可用于Cu2+的檢測。

2004年，Petty等[39]首次以單鏈DNA為模板，在NaBH4還原下合成了具有熒光性質(zhì)的Ag NCs，且證明了Ag+和胞嘧啶之間具有強烈結(jié)合力。此后，Ritchie等[40]發(fā)現(xiàn)Ag NCs的發(fā)射波長與DNA上Ag+的還原狀態(tài)有關(guān)，完全還原與非完全還原的Ag NCs表現(xiàn)出不同的發(fā)射波長，不同程度的非完全還原Ag NCs的發(fā)射波長也不同。由于Ag+與4種堿基(A,T,C,G)的親和力不同，可通過改變DNA的序列調(diào)節(jié)Ag NCs的熒光性質(zhì)。Richards等[41]利用基因芯片技術(shù)優(yōu)化出5條單鏈DNA序列，可用于合成不同熒光發(fā)射的Ag NCs，其發(fā)射波長從可見區(qū)到近紅外區(qū)。此外，雙鏈DNA也可用于Ag NCs的合成。Guo等[42]發(fā)現(xiàn)在雙鏈DNA上外加1個胞嘧啶小環(huán)，并以此為模板合成的Ag NCs具有較強的模板依賴性。隨后，Ma等[43]發(fā)現(xiàn)雙鏈DNA的錯配堿基位點可以特異性生長銀簇。Gwinn等[44]發(fā)現(xiàn)Ag NCs的光學性質(zhì)還可通過DNA的二級結(jié)構(gòu)調(diào)控，并首次以發(fā)卡DNA為模板，通過調(diào)節(jié)環(huán)部胞嘧啶的數(shù)目合成了4種Ag NCs。

1.3 熒光銅納米簇的合成

相比于貴金屬納米簇Au NCs與Ag NCs，有關(guān)銅納米簇(Cu NCs)的報道相對較少，主要是由于Cu NCs更易被氧化且制備過程中尺寸難以控制。硫醇類化合物中的巰基與Cu2+之間能形成Cu—S共價鍵，因此硫醇類化合物也能作為合成Cu NCs的配體。Wei等[45]利用2-巰基-5-丙烷基嘧啶為配體，在NaBH4還原下合成了具有雙發(fā)射的Cu NCs，在氧氣的電還原反應中表現(xiàn)出很高的電催化活性。由于某些聚合物在水溶液中能與Cu2+螯合，Zhao等[46]以含有叔胺的羥基封端的PAMAM為配體，利用叔胺與Cu2+的絡(luò)合作用，在NaBH4的還原下成功合成了Cu NCs。多肽和蛋白質(zhì)等生物大分子也能作為配體為Cu2+提供結(jié)合位點，Huang等[47]以多肽作為配體，在抗壞血酸的還原下制備了量子產(chǎn)率為7.3%的Cu NCs，其熒光具有溫度敏感性。Wang等[48]以BSA為配體，在水合肼的還原下制備了發(fā)射紅色熒光的Cu NCs，其熒光具有pH值響應性，可應用于細胞成像。

DNA分子中富含各種官能基團，如雜環(huán)氮、氨基、磷酸基等，能與不同的金屬離子結(jié)合，因而可用于各種金屬納米簇的合成。Rotaru 等[49]首次以雙鏈DNA為模板合成了具有熒光性質(zhì)的Cu NCs，發(fā)現(xiàn)通過控制雙鏈DNA的長度可以調(diào)節(jié)Cu NCs的尺寸和熒光(圖3A)。隨后，本課題組[50]系統(tǒng)地篩選了能夠作為配體分子穩(wěn)定合成Cu NCs的單鏈DNA，研究結(jié)果表明，在還原劑抗壞血酸鈉的存在下，只有聚胸腺嘧啶寡核苷酸Poly(thymine)能夠快速有效地穩(wěn)定合成熒光Cu NCs(圖3B)。

1.4 其他金屬納米簇的合成

除上述3種常見的金屬納米簇外，一些熒光金屬納米簇也被相繼合成。例如，Kawasaki等[51]將H2PtCl6加入N,N-二甲酰胺(DMF)溶液中，在140 ℃下油浴8 h，利用DMF的還原能力首次合成了鉑納米簇(Pt NCs)；Hyotanishi等[52]以PdCl2為金屬前驅(qū)體采用相同方法合成了鈀納米簇(Pd NCs)；Tanaka等[53]以巰基乙酸為配體合成了藍光發(fā)射的Pt5NCs，其量子產(chǎn)率達18%；以樹枝狀大分子[54]、GSH[55]等為配體制備的Pt NCs也相繼被報道。此外，為得到性質(zhì)更優(yōu)良的金屬納米簇，通過摻雜或偶聯(lián)的雙金屬或多金屬納米簇也被逐漸發(fā)展。它們一般以單金屬納米簇的制備方法為基礎(chǔ)，發(fā)展簡單的一步法或二步法進行合成，如Su等[56]以DNA為配體，加入前驅(qū)體Cu(NO3)2和AgNO3，在NaBH4還原下一步合成了DNA-Cu/Ag NCs，該納米簇的量子產(chǎn)率高達47%；依據(jù)此方法隨后又合成了DNA-Au/Ag NCs[57]。以BSA-Au NCs的合成方法為基礎(chǔ)，還合成了具有雙發(fā)射的BSA-Ce/Au NCs[58]。Zhang等[59]利用微波還原法快速簡便地制備了GSH-Au/Ag NCs，其量子產(chǎn)率相對于GSH-Au NCs也明顯提高。

圖4 尺寸對金屬材料的能級結(jié)構(gòu)影響[61]Fig.4 Effect of size on metal materials structure[61]

2 金屬納米簇的光學性質(zhì)

1961年，Kubo等[60]提出了著名的久保理論和納米粒子所具有的獨特的量子限域效應。進一步研究表明，當金屬粒子粒徑不斷減小時，能級間隔逐漸增大，當減小至與電子的費米波長相當時，電子能級由連續(xù)能級分裂成分立能級(圖4)[61]。因此，1～2 nm的金屬納米簇并不具備表面等離子共振(SPR)吸收性質(zhì)，但在一定波長的光作用下，金屬納米簇可實現(xiàn)能級之間的電子躍遷，從而表現(xiàn)出一定的光吸收和從可見到近紅外光區(qū)域的熒光發(fā)射性質(zhì)。金屬納米簇產(chǎn)生熒光的主要機理有兩種：與固有的量子尺寸效應相關(guān)的金屬內(nèi)核；由金屬核與表面配體間相互作用控制的納米簇表面[62]。此外，結(jié)構(gòu)、表面配體、氧化狀態(tài)、溫度、pH值、離子強度等因素也會影響金屬納米簇的光學性質(zhì)，其中表面配體的給電子能力是決定金屬納米簇量子產(chǎn)率的重要因素，配體給電子的能力越強，金屬納米簇的熒光越強。所以通過增加配體的給電子能力、增加金屬核所帶正電荷和使用富含給電子的原子或基團的配體可在一定程度上提高金屬納米簇的量子產(chǎn)率。

近年來，金屬納米簇的電化學發(fā)光(ECL)性質(zhì)不斷被開發(fā)和利用。金屬納米簇的ECL是電化學反應和化學反應的結(jié)合，通常具有熒光性質(zhì)的金屬納米簇均有電化學發(fā)光特性，但兩者發(fā)光的原理不同，電化學發(fā)光是自由基離子在外加電壓的激發(fā)下產(chǎn)生于電極表面，繼而形成激發(fā)態(tài)，當激發(fā)態(tài)向基態(tài)能級躍遷時伴隨光子產(chǎn)生，因而在基于金屬納米簇的ECL體系中，往往表現(xiàn)出更強的信號。

3 金屬納米簇在生物醫(yī)學中的應用研究

熒光金屬納米簇作為一種新型的熒光納米材料，相較于傳統(tǒng)的熒光染料和量子點，具有易制備、易修飾、尺寸超小、斯托克斯位移大、生物相容性良好，以及熒光光譜可調(diào)等優(yōu)勢，在生化分析、環(huán)境檢測、醫(yī)學成像和腫瘤治療方面具有廣泛的應用。

3.1 金屬納米簇在生物傳感中的應用

金屬離子廣泛存在于生物體中，參與生物體內(nèi)各種復雜的生化過程，以維持生命體系的一切正?；顒樱S多金屬離子(如Cu2+、Fe3+等)超過一定濃度時均具有毒性作用。基于金屬納米簇較高的物化活性，目前已構(gòu)建了多種簡便的傳感平臺用于金屬離子的高靈敏檢測[63-64]。其中Cu2+的檢測大多是基于Cu2+對熒光猝滅的原理，如Yuan等[65]利用hPEI合成了高穩(wěn)定的Ag NCs，Cu2+通過結(jié)合hPEI的氨基形成銅氨絡(luò)合物，與Ag NCs發(fā)生能量轉(zhuǎn)移導致熒光猝滅，將該材料包埋于水凝膠中，進而發(fā)展了一種Cu2+的可視化檢測方法，檢出限達10 nmol/L。但熒光猝滅型傳感器易受外界環(huán)境的干擾，產(chǎn)生“假陽性”信號，Lan等[66]針對這一缺陷發(fā)展了基于DNA-Ag NCs的熒光增強型Cu2+傳感器，Cu2+加入DNA-Ag NCs后形成了結(jié)構(gòu)緊密、熒光更強的DNA-Cu/Ag NCs，該方法具有很好的選擇性，檢出限為8 nmol/L。為提高Cu2+檢測的靈敏度，Yan等[67]合成了組氨酸(His)穩(wěn)定的Au NCs，并首次利用其過氧化物酶活性實現(xiàn)了Cu2+的比色檢測，His-Au NCs在H2O2的存在下可催化四甲基聯(lián)苯胺(TMB)發(fā)生顯色反應，Cu2+加入后與His的氨基、羧基及咪唑環(huán)結(jié)合會抑制該Au NCs的酶活性，該方法的線性范圍為1～100 nmol/L，檢出限可達0.1 nmol/L。近年來，利用金屬納米簇還實現(xiàn)了血清和活細胞中Fe3+的分析檢測，F(xiàn)eng等[68]利用hPEI為配體合成了Fe3+響應的Cu NCs，并實現(xiàn)了在血清等復雜樣品中對Fe3+的靈敏檢測；Huang等[69]發(fā)現(xiàn)以硫辛酸為配體合成的Au/Ag NCs對Fe3+具有較好的響應，基于團聚導致熒光猝滅原理構(gòu)建了Fe3+熒光傳感方法并成功應用于活細胞成像。此外，金屬納米簇也被應用于其他離子如Ag+、As3+、Cd2+、Cr3+、Cr6+、Hg2+和Pb2+[3,11,70-71]等的檢測。

生物分子作為生物體特有的物質(zhì)，其含量水平與生命活動息息相關(guān)。其中生物巰基分子(GSH)、半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)是許多多肽和蛋白質(zhì)的重要組成部分，在細胞的氧化還原平衡、癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，且三者之間緊密聯(lián)系。Huang等[72]構(gòu)建了基于DNA-Ag NCs的熒光增強型傳感器用于生物巰基化合物的檢測，由于DNA-Ag NCs具有很強的DNA序列及DNA結(jié)構(gòu)依賴性，通過優(yōu)化合成Ag NCs的DNA序列，得到了具有GSH、Cys和Hcy響應的熒光探針。Xu等[73]以巰基十一酸和甲硫氨酸為配體一步法合成了橘黃色發(fā)射的Au NCs，利用Au NCs和GSH競爭性結(jié)合Cu2+誘導熒光變化而實現(xiàn)了GSH的檢測，檢出限為9.7 nmol/L，并成功應用于活細胞內(nèi)GSH的監(jiān)測。Zhang等[74]利用聚胸腺嘧啶寡核苷酸(Poly(thymine))為模板合成的Cu NCs構(gòu)建了一種免標的納米傳感器，結(jié)合Thymine-Hg2+-Thymine的作用機制，實現(xiàn)了對GSH、Cys和Hcy的快速檢測。三磷酸腺苷(ATP)作為生物體新陳代謝的能量物質(zhì)，其能量和消耗速率與許多疾病的發(fā)生有關(guān)，Zhang等[75]首次發(fā)現(xiàn)相鄰的DNA-Ag NCs與G四聚體/氯化血紅素(Hemin)復合物之間存在的光致電子轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(PET)可用于ATP的特異性檢測，設(shè)計了含ATP的核酸適配體(Aptamer)、富G序列及Ag NCs模板序列的DNA序列。當ATP和Hemin存在時，Aptamer構(gòu)象發(fā)生改變，G四聚體/Hemin隨之形成，并與DNA-Ag NCs產(chǎn)生PET效應導致熒光猝滅，ATP的檢出限為8 nmol/L。除了熒光猝滅型傳感器，Xu等[76]和Zhou等[77]發(fā)展了基于DNA-Ag NCs和DNA-CuNCs的熒光增強型探針用于ATP的檢測。此外，熒光金屬納米簇還被廣泛應用于生物大分子核酸和蛋白質(zhì)的檢測，核酸的定量檢測有利于對生理狀態(tài)進行實時監(jiān)測，并對臨床診斷起到很好的指導作用。Liu等[78]構(gòu)建了DNA-Ag NCs/氧化石墨烯(GO)體系，利用GO可以吸附單鏈DNA并猝滅熒光的原理，通過設(shè)計DNA序列實現(xiàn)了多種目標物的檢測，包括乙型病毒(HBV)等病原DNA以及ATP、凝血酶等生物分子。Miao等[79]建立了一種基于DNA-Ag NCs和金納米顆粒熒光猝滅作用的miRNA檢測方法，通過對DNA-Ag NCs的DNA進行功能化，即設(shè)計其中一端用于合成Ag NCs，另一端與miRNA互補用于捕獲靶標和吸附帶正電的Au NPs以猝滅Ag NCs的熒光，在雙聯(lián)特異性核酸酶(DSN酶)的作用下，DNA/RNA雜交鏈中的DNA鏈被水解，Ag NCs遠離Au NPs表面，熒光得到恢復，該方法的miRNA檢出限為33.4 fmol/L。目前，以不同的金屬納米簇為敏感探針構(gòu)建的化學傳感平臺也被應用于可卡因[80]、H2O2[81]、活性氧(ROS)[82]等的檢測。

pH值和溫度是生物體內(nèi)最基本的生理參數(shù)，它們調(diào)控著大多數(shù)細胞內(nèi)生物分子的活性，對于衡量生命活動正常與否至關(guān)重要，監(jiān)測細胞內(nèi)的pH值和溫度對分析細胞行為和疾病診斷及治療有重要意義[83-84]。Chen等[58]利用一步法合成的雙發(fā)射BSA-Ce/Au NCs作為pH值敏感探針，構(gòu)建了一種比率型pH傳感器，在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)，該探針的熒光信號比率I410/I650與pH值存在良好的線性關(guān)系，且具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，已成功應用于HeLa細胞內(nèi)的pH值監(jiān)測。近年來發(fā)現(xiàn)Cu NCs也可作為pH值指示材料，Zhang等[85]利用絲蛋白為配體合成了具有藍光發(fā)射的Cu NCs，在一定范圍內(nèi)，其熒光信號與pH值變化成正比。Wu等[86]將pH值敏感的異硫氰酸熒光素(FITC)染料交聯(lián)到BSA-Au NCs表面，發(fā)展了一種可用于pH值和溫度傳感的熒光探針，并實現(xiàn)了對活細胞內(nèi)pH值和溫度的監(jiān)測。Zhou等[87]報道了一種雙熒光DNA-Ag NCs探針用于溫度傳感，該探針由兩條含Ag NCs單鏈DNA通過堿基互補配對雜交組成，傳感機制是基于溫度的升高導致兩條DNA逐漸解鏈，從而使銀簇對分開，熒光隨之發(fā)生變化。除了利用金屬納米簇的熒光強度作為信號對溫度進行傳感外，Shang等[88]還利用Au NCs的熒光壽命作為信號實現(xiàn)了活細胞內(nèi)的溫度傳感。

3.2 金屬納米簇在生物成像中的應用

除了在生物傳感中的應用，許多金屬納米簇也被應用于生物成像領(lǐng)域，尤其是以蛋白質(zhì)、多肽等生物內(nèi)源性分子為配體合成的金屬納米簇，它們往往具有生物相容性好、易功能化修飾的特點，在生物成像應用中表現(xiàn)出獨特的優(yōu)越性。Wang等[89]以GSH-Ag NCs前體為配體，利用電化學還原法合成了具有紅光發(fā)射的Au NCs，量子產(chǎn)率為10%，該Au NCs在癌細胞和正常細胞的成像中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和生物相容性。由于癌細胞中GSH的濃度遠高于正常細胞的濃度[90]，Chen等[91]將此特性應用于Pt NCs在癌細胞內(nèi)的原位合成并實現(xiàn)了細胞成像(圖5A)。此外，金屬納米簇通過表面功能化后用于靶向腫瘤細胞的成像研究也相繼報道，葉酸[92]、TAT肽段[93]、RGD肽段[94]、Aptamer[95]等生物分子的靶向功能化修飾在生物成像中發(fā)揮著越來越重要的作用。為避免細胞成像時的自發(fā)熒光和背景熒光的干擾，許多研究者基于材料的特性引入了雙光子成像技術(shù)并得到了更深層次的細胞成像效果。Shang等[96]發(fā)展了新型的DPA-Au NCs，利用雙光子成像技術(shù)實現(xiàn)了對HeLa細胞橫截面的3D成像。隨后，功能化的BSA-Au NCs[97-98]利用雙光子成像技術(shù)在腫瘤細胞中也得到了應用。此外，熒光壽命成像技術(shù)也能弱化成像時生物組織自發(fā)熒光和背景熒光的缺點，Shang等[88]以硫辛酸-Au NCs作為熒光探針，利用其熒光壽命的溫度敏感性，發(fā)展了一種活細胞中溫度響應的熒光壽命成像方法(FLIM)，在生理溫度范圍內(nèi)，Au NCs的熒光壽命變化范圍為970～670 ns(圖5B)。利用Ag NCs對細胞進行熒光壽命成像的研究也早有報道[99]。

除了上述利用金屬納米簇熒光性質(zhì)進行單一模式的細胞成像，多模式的成像技術(shù)在細胞及活體層面也得到了發(fā)展和應用。Wang等[100]采用聲波還原法合成了GSH-Cu NCs，利用該Cu NCs近紅外熒光發(fā)射和順磁性質(zhì)的特性，將近紅外熒光(NIRF)/核磁共振(MRI)雙模式成像技術(shù)成功應用于HeLa細胞內(nèi)。目前，基于鑭系元素離子Gd3+的造影劑廣泛應用于腫瘤的成像，Hou等[101]發(fā)展了由Gd3+介導Au NCs自組裝形成的納米顆粒(GNCNs)用于癌癥多模式成像的方法，Gd3+的加入使復合納米顆粒的熒光大大增強，利用該材料實現(xiàn)了在A549細胞和活體內(nèi)的NIRF/CT/MRI多模式成像。

3.3 金屬納米簇在腫瘤治療中的應用

基因治療在腫瘤治療中表現(xiàn)出良好的應用前景，其面臨的挑戰(zhàn)之一是需引入安全、靶向、高效的載體系統(tǒng)。金屬納米簇作為一種新型的熒光納米材料，具有生物相容性好、穩(wěn)定性高、易于合成與修飾等(基因治療載體系統(tǒng)所必需的)諸多優(yōu)點，可在一定程度上提高該治療模式的應用價值。Tao等[102]合成了聚乙烯亞胺(PEI)-Au NCs，利用PEI的“質(zhì)子海綿效應”，將PEI-Au NCs作為一種安全有效的基因載體實現(xiàn)了HepG2中pDNA的高效轉(zhuǎn)運與轉(zhuǎn)染。高分子量的PEI具有高效的轉(zhuǎn)染效率，而Au NCs在很大程度上降低了高分子量PEI的毒性，因此PEI-Au NCs在基因治療中表現(xiàn)出很好的應用前景?；陬愃圃?，Wang等[103]發(fā)現(xiàn)PEI-Cu NCs也可作為載體且表現(xiàn)出基因轉(zhuǎn)運的潛力。Vankayala等[104]利用細胞核定位肽(TAT)對Au NCs進行靶向功能化，Au NCs的熒光和核染料在細胞中實現(xiàn)了共定位，結(jié)果表明TAT-Au NCs在HeLa細胞和斑馬魚中的轉(zhuǎn)染效率達81%，是常用脂質(zhì)體載體的3.2倍。Dutta等[105]將自殺基因整合到pDNA內(nèi)，然后通過靜電作用吸附到BSA-AuAg NCs上，根據(jù)AuAg NCs的熒光信號可對基因轉(zhuǎn)運進行成像，Caspase 3活性檢測表明該基因治療體系對腫瘤細胞起到了較好的凋亡作用。Lei等[106]發(fā)現(xiàn)GSH-Au NCs結(jié)合神經(jīng)生長因子NGF的siRNA(GNC-siRNA)可使NGF基因沉默并提高胰腺癌治療效率，GNC-siRNA復合物增加了siRNA在血清中的穩(wěn)定性，延長了siRNA在血液中的循環(huán)壽命，增強了siRNA的細胞攝取和腫瘤積累。另外，將功能化的Ag NCs作為載體轉(zhuǎn)運siRNA也有報道[107]。

隨著生物納米材料的發(fā)展及其向醫(yī)學領(lǐng)域的不斷滲透，熒光納米材料和腫瘤化學治療相結(jié)合逐漸成為當前攻克腫瘤研究的重要手段，其中金屬納米簇所具有的光學性質(zhì)和生物相容性使其在該領(lǐng)域中表現(xiàn)出良好的應用前景。Khandelia等[98]構(gòu)建了一種裝載Au NCs和阿霉素(Dox)的納米診療復合粒子，該復合粒子既可對癌細胞進行雙光子成像，又可對癌細胞達到化學治療的作用。Chen等[108]對Au NCs@His進行癌細胞內(nèi)外的雙靶向修飾和藥物交聯(lián)，發(fā)展了基于Au NCs-Dox-cRGD-Aptamer的診療一體化納米平臺，提高了藥物對腫瘤組織的親和力與滲透率，實現(xiàn)了腫瘤部位的成像及藥物的靶向遞送。Zhou等[109]制備了BSA-Au NCs連接順鉑和葉酸的納米藥物復合物，結(jié)果表明基于Au NCs的納米平臺在腫瘤的成像和治療方面具備良好的發(fā)展前景。另外，Cu NCs也具有此方面的潛力，如圖6所示，Goswami等[110]直接以具有癌細胞靶向性的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)作為配體合成了Tf-Cu NCs，并利用靜電相互作用力裝載Dox制備了Tf-Cu NCs-Dox NPs，Dox與Cu NCs之間存在熒光共振能力轉(zhuǎn)移(FRET)效應，當該靶向型納米顆粒進入癌細胞后，Cu NCs的熒光隨著Dox的釋放而恢復，利用FRET策略對腫瘤組織達到了診療一體化的目的。

腫瘤的物理治療主要是利用光對癌變組織進行放療及光動力學治療。首先，X射線可以離子化DNA分子，或與H2O作用生成活性氧物質(zhì)，其中·OH可誘導細胞DNA發(fā)生損傷達到治療腫瘤的目的[111]；另一方面，高原子序數(shù)的金屬元素在X射線誘導下發(fā)生生化反應，反應產(chǎn)物與癌細胞內(nèi)水分子反應生成自由基，可使DNA發(fā)生電子轉(zhuǎn)移而被氧化，因此某些金屬納米簇有放療增敏的作用[112]。Zhang等[113]在利用Au NCs作為放療增敏劑提高腫瘤放療效果的研究中做了先導性的工作，研究結(jié)果表明超小尺寸的Au NCs可以避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，有效提高腫瘤的放療療效?；诖?，Liang等[114]采用c(RGDyC)肽為配體，結(jié)合其癌細胞靶向功能制備了具有腫瘤靶向及放療增敏作用的Au NCs。基于金屬納米簇表面官能團與光敏劑交聯(lián)可應用于腫瘤的光動力學治療(PDT)，Nair 等[115]將原卟啉(PPIX)與葉酸修飾的硫辛酸-Au NCs共價交聯(lián)，利用該材料實現(xiàn)了活體中腫瘤部位的光動力學治療的實時成像。PPIX還可與近紅外發(fā)射的Aptamer(AS1411)-Ag NCs通過G四聚體相連，基于此方法，Ai等[116]構(gòu)建了基于DNA-Ag NCs的診療一體化平臺。研究表明，在腫瘤細胞內(nèi)會產(chǎn)生抗氧化防御機制以應對持久的PDT治療，例如過度表達硫環(huán)蛋白還原酶(TrxR)可以抵抗細胞內(nèi)增加的ROS水平[117]，Gao等[118]發(fā)現(xiàn)Au NCs能有效抑制腫瘤細胞內(nèi)TrxR，將Au NCs和光敏劑二氫卟吩e6(Ce6)同時負載到pH敏感性脂質(zhì)體中，在細胞內(nèi)溶酶體酸性環(huán)境下，Au NCs和Ce6被快速釋放到胞漿，金簇有效抑制了胞漿內(nèi)的TrxR，使得細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS不能被及時清除，提高了Ce6介導的光動力學誘發(fā)的細胞內(nèi)ROS水平，改善了PDT的治療效應。而且，某些金屬納米簇可直接作為光敏劑用于光動力學治療。Kawasaki等[119]研究發(fā)現(xiàn)以苯乙硫醇或卡托普利為配體合成的Au NCs具有光敏劑特性，在可見/近紅外光激發(fā)下能夠有效地產(chǎn)生單線態(tài)氧，并基于以上獨特的性質(zhì)，使用卡托普利-Au NCs作為生物相容性光敏劑實現(xiàn)了對癌細胞的光動力學治療。Vankayala等[104]利用TAT肽段對Au NCs進行靶向功能化，以TAT-Au NCs作光敏劑實現(xiàn)了HeLa細胞的光動力學治療。

圖5 Pt NCs在癌細胞內(nèi)的原位生物合成及熒光成像(A)[91]，以及硫辛酸-Au NCs作為熒光探針在不同溫度下對HeLa細胞進行熒光壽命成像(B)[88]Fig.5 In situ biosynthesis of Pt NCs and cell imaging(A)[91],and FLIM images of HeLa cells with internalized Au NCs at different temperatures(B)[88]

圖6 與Tf-Cu NCs-Dox NPs孵育不同時間后HeLa細胞的熒光共焦顯微鏡圖像(A)，及Tf-Cu NCs-Dox NPs對小鼠的腫瘤抑制能力監(jiān)測(B)[110]
Fig.6 Fluorescence confocal microscopy images of HeLa cells at different time of treatment(A),and experimental scheme representing the effect of Tf-Cu NCs-Dox NPs in tumor bearing Swiss albino mice monitored for 50 days(B)[110]

4 結(jié)論與展望

本文系統(tǒng)地介紹了不同金屬納米簇的合成方法和熒光性質(zhì)，并從生物傳感、生物成像和腫瘤治療三方面總結(jié)了近年來它們在生物醫(yī)學領(lǐng)域的研究進展。熒光金屬納米簇作為一種新型的熒光納米材料，不僅擁有良好的熒光性質(zhì)，還有更好的生物相容性。此外，配體合成的熒光金屬納米簇通常還有易于修飾的特點，從而可對其熒光性質(zhì)、靶向識別等進行調(diào)整和優(yōu)化。這些優(yōu)良特性，使金屬納米簇在生物醫(yī)學領(lǐng)域展現(xiàn)出更多的應用潛能。

盡管金屬納米簇在生物醫(yī)學領(lǐng)域已取得一定成果，但進一步的發(fā)展還面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。首要解決的問題是如何制備純度和量子產(chǎn)率更高的金屬納米簇。與量子點和有機染料相比，目前所合成的金屬納米簇量子產(chǎn)率偏低，實現(xiàn)金屬納米簇中金屬核組分與尺寸可控合成、增加表面配體的給電子能力等是解決該問題的突破口。其次，由于金屬納米簇本身具有較高的物化活性，而在生物成像或治療應用時往往需要更為準確且穩(wěn)定的熒光信號，因此如何在細胞或活體等復雜生物環(huán)境中提升該熒光材料的抗干擾能力是非常重要的。最后，金屬納米簇的表面功能化對于其在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應用研究十分關(guān)鍵，一方面，金屬納米簇作為傳感器、熒光染料、基因載體或藥物載體等角色，高效率的表面功能化修飾有利于其更好的發(fā)揮作用；另一方面，功能化修飾會使金屬納米簇表面的化學基團發(fā)生變化，從而導致材料本身的熒光性質(zhì)發(fā)生變化。許多研究表明，以熒光金屬納米簇為基礎(chǔ)構(gòu)建的生物標記、生物傳感、生物成像以及靶向的腫瘤治療平臺具有十分廣闊的前景，但將其應用于臨床實踐尚需結(jié)合其他功能性材料進行更多深入、系統(tǒng)的研究。通過將金屬納米簇的優(yōu)良性質(zhì)與其他造影劑或治療藥物相結(jié)合，有望實現(xiàn)多功能金屬納米復合材料的合成及多模態(tài)成像與治療的應用，為臨床實踐提供堅實的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持?？傊?，隨著理論基礎(chǔ)、合成技術(shù)以及各方面技術(shù)的綜合發(fā)展，熒光金屬納米簇將為生物醫(yī)學領(lǐng)域的研究提供新的契機，為細胞內(nèi)傳感、成像以及治療開拓新的途徑。