趙鳳姣，千佳麗，孫圓圓，王兆彥，周 雷*

(1.蘭州大學 化學化工學院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000)

作為一種新興的碳納米材料，碳點(CDs)具有優(yōu)良的光學性質、較好的生物相容性和低的細胞毒性[1-3]，在生物成像、疾病診斷、化學傳感和光催化等領域具有廣闊的應用前景[4-8]。近年來，碳點的制備與應用受到科研工作者的廣泛關注[9-10]。然而，目前報道的碳點的量子產(chǎn)率偏低且熒光多為藍色，嚴重限制了此類材料的應用。因此，提高碳點的量子產(chǎn)率并調(diào)控其發(fā)射波長是該領域亟待解決的問題。

以小分子為前驅體采用“自下而上”法制備的碳點通常能獲得較高的量子產(chǎn)率。其中以檸檬酸為前驅體，通過改變共摻雜試劑制備的系列碳點具有優(yōu)異的量子產(chǎn)率[11-18]，相對量子產(chǎn)率最高可達94%[14]。研究推測，檸檬酸基碳點的形成首先是檸檬酸分子中的3個羧基與氨基形成聚合物中間體，隨后進一步碳化生成熒光碳點[11,19-20]；也有研究者認為，檸檬酸分子在一定條件下能自組裝形成層狀結構，然后通過分子間脫水形成碳點[12,14-16,18,21-22]。檸檬酸基碳點雖然量子產(chǎn)率較高，但其所發(fā)射的熒光多為藍色，盡管可以通過改變激發(fā)波長調(diào)控碳點的發(fā)射波長，但該方法獲得的長波長發(fā)射的量子產(chǎn)率急劇下降，嚴重影響了此類碳點在生物學領域的應用[23-26]。因此，研究者通過改變不同的前驅體，以獲得不同發(fā)射波長的碳點[27-28]；或通過控制碳點粒徑大小和表面的氧化程度來調(diào)控其熒光發(fā)射[29]。粒徑大小、表面狀態(tài)、摻雜元素等因素均會影響碳點的量子產(chǎn)率和發(fā)射波長，但上述因素如何影響碳點的熒光性質，至今尚無明晰的理論解釋?；诖?，發(fā)展新型的長波長碳點以及研究總結碳點的發(fā)射波長調(diào)控理論很有必要。

與檸檬酸相比，烏頭酸(AA)的分子骨架中存在1個不飽和的碳碳雙鍵，因而推測其是一種更為理想的碳點前驅體[30-31]。本實驗以烏頭酸為碳源，通過組合碳點制備中最常用的共摻雜試劑(乙二胺(EDA)或尿素(Urea))和碳化方法(水熱法或微波法)，分別制得4種光學性質優(yōu)良的碳點(AA&EDA-HT-CDs、AA&EDA-MW-CDs、AA&Urea-HT-CDs、 AA&Urea-MW-CDs)。其中3種碳點發(fā)射藍色熒光，1種發(fā)射黃色熒光。本實驗選定藍色熒光碳點中量子產(chǎn)率最高的AA&EDA-HT-CDs 和黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs為對象，系統(tǒng)研究了其光學性質和形貌特征，并考察了其在分析化學中的應用潛力。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

烏頭酸(98%,Alfa-Aesar公司)；乙二胺(99%,天津百世化工有限公司)；尿素(99%,天津光復化工有限公司)。其他試劑均為市售分析純，實驗用水為超純水，所有試劑未經(jīng)純化直接用于實驗。

家用微波爐(700 W,Midea公司)。碳點的紫外可見吸收光譜由UV 2800SPC分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)測量，熒光光譜由F97Pro熒光分光光度計(上海棱光技術有限公司)測量，測試時使用石英比色皿(10 mm×10 mm)。碳點的絕對量子產(chǎn)率及熒光壽命通過FLS920光譜儀(Edinburgh Instruments，U.K.)測定。透射電子顯微鏡照片用Tecnai F30(荷蘭)拍攝，加速電壓為200 kV。紅外光譜用傅立葉變換紅外光譜儀(NEXUS 670，Nicolet)進行測定。碳點的元素組成由Vario EL元素分析儀(Elementar，Germany)測定。粒徑分布通過BI-200SM動態(tài)光散射儀(Brookhaven，USA)進行測定。X-射線光電子能譜用X-射線光電子能譜儀(XPS，PHI 5702)進行測定。RT-6100酶標分析儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司)和激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV-1000，405 nm，Japan)用于細胞毒性(MTT法)實驗和細胞成像實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1水熱法制備烏頭酸基碳點將0.087 1 g烏頭酸和100.4 μL 乙二胺或0.225 1 g尿素溶于5 mL水中，反應溶液轉移至聚四氟乙烯內(nèi)襯水熱合成釜中，置于烘箱中于180 ℃下反應5 h。反應完成后自然冷卻至室溫，將反應產(chǎn)物轉移至培養(yǎng)皿中，在真空干燥箱中50 ℃條件下干燥8 h，得棕色粉末固體產(chǎn)物，分別命名為AA&EDA-HT-CDs和AA&Urea-HT-CDs。

1.2.2微波法制備烏頭酸基碳點將0.087 1 g烏頭酸和100.4 μL 乙二胺或0.360 4 g尿素溶于盛有5 mL水的錐形瓶中，將錐形瓶置于微波爐內(nèi)，700 W功率下加熱6 min或5 min。錐形瓶中的無色澄清溶液轉變?yōu)楹稚腆w即表示熒光碳點生成。將錐形瓶置于真空干燥箱中50 ℃下干燥2 h，冷卻至室溫后將固體研磨成均勻的粉末用于后續(xù)實驗，分別命名為AA&EDA-MW-CDs和AA&Urea-MW-CDs，其中AA&Urea-MW-CDs用反相硅膠柱進一步純化。

1.2.3烏頭酸基熒光碳點的細胞毒性實驗細胞毒性用MTT 法進行評價：將肝癌細胞SMMC-7721接種在盛有RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute-1640)培養(yǎng)基(100 μL/孔，5%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)的96孔板中(約104個細胞/孔)，在5% CO2、37 ℃下于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。18 h后，向96孔板的實驗組中加入適當濃度的碳點溶液，使其最終濃度由上到下依次為1 500、1 000、500、250、125 mg/L；對照組細胞培養(yǎng)過程中未加碳點溶液，于5% CO2、37 ℃下繼續(xù)孵育36 h。隨后更換新的培養(yǎng)基并向每孔加入10 μL的噻唑藍(MTT，5 g/L)繼續(xù)孵育4 h。除去培養(yǎng)基后，向各孔中加入100 μL DMSO并振蕩搖勻，10 min內(nèi)用酶標儀測定 490 nm 處的吸光度，依據(jù)下式計算并評估碳點對肝癌細胞的影響狀況：Cell Viability(%)=ODTreated/ODControl×100%，其中,ODTreated為加入碳點的實驗組的吸光度；ODControl為未加碳點的對照組的吸光度。

1.2.4烏頭酸基熒光碳點的細胞成像實驗將肝癌細胞SMMC-7721接種在盛有RPMI-1640培養(yǎng)基(1 mL/孔)的12孔板中(約含有106個細胞)，在5% CO2、37 ℃下于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。向12孔板中加入適當濃度的AA&EDA-HT-CDs(800 mg/L)和AA&Urea-MW-CDs(800 mg/L)溶液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h后，棄去培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖溶液(PBS，10 mmol/L，pH 7.4)沖洗3次，用激光共聚焦顯微鏡采集成像結果。

2 結果與討論

2.1 烏頭酸基碳點的熒光性能

以烏頭酸為碳源，乙二胺或尿素為共摻雜試劑，通過水熱法和微波法分別制得3種藍色熒光碳點(AA&EDA-HT-CDs、AA&EDA-MW-CDs、AA&Urea-HT-CDs)和1種黃色熒光碳點(AA&Urea-MW-CDs)。4種烏頭酸基碳點的制備條件列于表1，后續(xù)實驗以藍色熒光碳點中量子產(chǎn)率最高的AA&EDA-HT-CDs和黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs為研究對象。在自然光下，AA&EDA-HT-CDs和AA&Urea-MW-CDs的水溶液均澄清透明；在紫外燈(365 nm)下，AA&EDA-HT-CDs溶液發(fā)射出明亮的藍色熒光(圖1A插圖)，而AA&Urea-MW-CDs溶液呈黃色熒光(圖1B插圖)。在固體狀態(tài)下，AA&EDA-HT-CDs在紫外燈下無熒光，而AA&Urea-MW-CDs在紫外燈下也能發(fā)射黃色熒光。由熒光光譜圖可見，AA&EDA-HT-CDs的最佳激發(fā)波長為360 nm，最佳發(fā)射波長為441 nm，且譜線的半寬度較窄，僅為60 nm。其發(fā)射波長在激發(fā)波長由320 nm逐漸增至400 nm的過程中保持不變(圖1A)，顯示出激發(fā)不依賴的光學性質。AA&Urea-MW-CDs的最佳激發(fā)波長為415 nm，最佳發(fā)射波長為525 nm。在激發(fā)波長由380 nm逐漸增至460 nm的過程中，其發(fā)射波長出現(xiàn)微弱紅移(圖1B)。通過絕對法測得AA&EDA-HT-CDs和AA&Urea-MW-CDs的量子產(chǎn)率分別為57%和44%。紫外可見吸收光譜顯示，4種碳點在245 nm附近均有吸收，這是由于碳核中心存在π-π*躍遷。此外，黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs還在325 nm和410 nm處有吸收，而藍色熒光碳點AA&EDA-HT-CDs僅在350 nm處有吸收(圖1)。

表1 烏頭酸基熒光碳點的制備條件及光學性質Table 1 Preparation conditions and fluorescence properties of aconitic acid derived CDs

圖1 AA&EDA-HT-CDs(A)和AA&Urea-MW-CDs(B)的熒光光譜及紫外可見吸收光譜(黑線)
Fig.1 Fluorescence spectra and UV-Vis absorption spectra(black line) for AA&EDA-HT-CDs(A) and AA&Urea-MW-CDs(B)insert:photographs of AA&EDA-HT-CDs and AA&Urea-MW-CDs under daylight(left) and UV lamp(right，365 nm)，respectively

4種烏頭酸基碳點的最佳激發(fā)/發(fā)射波長、量子產(chǎn)率(QY)及熒光壽命(τ)見表1。由表可知，摻雜試劑和碳化方法均會對碳點的熒光性質產(chǎn)生影響。就量子產(chǎn)率而言，乙二胺作為摻雜試劑所得碳點的量子產(chǎn)率整體高于尿素作為摻雜試劑的碳點。此外，以乙二胺作為摻雜試劑時，制備方法對碳點的熒光波長無顯著影響，但水熱法制得碳點的量子產(chǎn)率高于微波法。而以尿素作為摻雜試劑時，相比于水熱法，微波法制得的碳點熒光波長顯著紅移，且量子產(chǎn)率更高。4種碳點的時間分辨熒光信號均為雙指數(shù)衰減模式，黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs的兩個熒光壽命占比相差不大，分別為60.32%(4.53 ns)和39.68%(8.26 ns)。而對于另外3種藍色熒光碳點，兩個熒光壽命中的一個占比超過90%，表明雖然存在兩條電子躍遷路徑，但其中一條路徑占絕對優(yōu)勢。綜上，4種碳點表現(xiàn)出不同的熒光性質，其原因可能是由于微波法制備碳點的過程中加熱速度較快，所得碳點表面產(chǎn)生了更多的缺陷，這些缺陷為電子的轉移提供了多條路徑。

2.2 烏頭酸基碳點的結構表征

采用透射電鏡(TEM)、傅立葉紅外光譜(FTIR)、X-射線光電子能譜(XPS)等多種技術對藍色熒光碳點AA&EDA-HT-CDs和黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs的結構特征進行表征。由TEM照片(圖2)可見，AA&EDA-HT-CDs和AA&Urea-MW-CDs均近似球形且具有良好的分散性，平均粒徑分別為1.6 nm和3.6 nm。粒徑統(tǒng)計結果則顯示，水熱法制備的碳點具有更均一的粒徑。4種碳點的元素分析結果列于表2。與藍色熒光碳點AA&EDA-HT-CDs相比，黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs具有更高含量的氮元素和較低含量的氫元素，其原因可能是使用了不同的制備方法和共摻雜試劑，導致各碳點在元素種類及含量上的差異。

CDsCNHO(Calculated)AA&EDA-HT-CDs27.6411.454.0156.90AA&EDA-MW-CDs47.7318.636.4527.19AA&Urea-HT-CDs38.4914.935.8240.76AA&Urea-MW-CDs31.0332.442.6733.86

圖3 AA&EDA-HT-CDs及AA&Urea-MW-CDs的紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of AA&EDA-HT-CDs and AA&Urea-MW-CDs

2.3 烏頭酸基碳點的離子響應特性

由于烏頭酸基碳點的表面含有豐富的含氧和含氮基團，易與某些金屬離子絡合，導致碳點的熒光猝滅，據(jù)此可設計某些特定金屬離子的傳感測定方法。為評價烏頭酸基碳點應用于分析領域的潛力，考察了溶液pH值和離子強度對碳點熒光的影響，結果顯示，在強酸或強堿條件下，4種碳點溶液均出現(xiàn)熒光猝滅，但在溶液pH 5.0～10.0范圍內(nèi)，4種碳點的熒光強度均保持穩(wěn)定。此外，4種碳點在不同濃度NaCl溶液中的熒光強度基本保持不變。這些特性預示了烏頭酸基熒光碳點在生命分析領域具有潛在的應用價值。選擇 Li+、K+、Ag+、Pb2+、Ba2+、Cd2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Hg2+、Cr3+、Fe3+、Al3+共18種常見的金屬離子作為研究對象，篩查了所制備4種碳點的離子響應特性，金屬離子濃度均為60 μmol/L。結果顯示，AA&Urea-HT-CDs對Hg2+有較強的響應，對Fe3+也有一定的響應；AA&EDA-MW-CDs對Hg2+有較強的響應，但其熒光猝滅程度與AA&Urea-HT-CDs相比稍弱；而另兩種碳點對18種金屬離子均無響應。金屬離子通常會與碳點表面的基團相互作用而導致碳點的熒光猝滅[5]，據(jù)此可以認為，4種碳點的不同離子響應特性來源于其表面基團的差異，這與FTIR和XPS表征的結論一致。在此基礎上，基于AA&EDA-MW-CDs發(fā)展了環(huán)境水體中Hg2+的測定方法[30]。

2.4 烏頭酸基碳點的細胞成像實驗

進行細胞染色實驗前，采用MTT實驗評估了藍色熒光碳點AA&EDA-HT-CDs和黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs對肝癌細胞(SMMC-7721)生長的影響(圖6A、C)，結果表明，經(jīng)兩種碳點孵育的細胞均未出現(xiàn)明顯的死亡或形態(tài)變化，說明烏頭酸基碳點具有較好的生物相容性。細胞成像實驗顯示，兩種碳點均能很好地進入細胞，實現(xiàn)細胞的染色(圖6B、D)。對比成像實驗結果發(fā)現(xiàn)，藍色熒光碳點AA&EDA-HT-CDs僅分布在細胞質中，而黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs可部分進入細胞核。進一步研究了不同濃度的AA&Urea-MW-CDs孵育細胞后的成像情況，結果顯示，較低濃度的AA&Urea-MW-CDs孵育細胞后，細胞核染色現(xiàn)象不明顯，但隨著碳點濃度的增加，細胞核中的熒光信號逐漸增強，說明AA&Urea-MW-CDs具有細胞核染色能力。通常而言，粒徑小于8 nm，且能夠與核酸和染色質發(fā)生相互作用的納米顆粒才能夠進入細胞核[32]。本實驗中，粒徑較大的AA&Urea-MW-CDs(3.6 nm)比粒徑較小的AA&EDA-HT-CDs(1.6 nm)更易進入細胞核，推測是因為AA&Urea-MW-CDs的表面基團使其更易與核酸和染色質發(fā)生相互作用。

3 結 論

本文以烏頭酸為前驅體，乙二胺或尿素為共摻雜試劑，分別采用水熱法和微波法，制備了4種光學性質優(yōu)良的熒光碳點，其中3種發(fā)射藍色熒光，1種發(fā)射黃色熒光。藍色熒光碳點AA&EDA-HT-CDs 的絕對量子產(chǎn)率為57%，黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs的絕對量子產(chǎn)率為44%，采用多種手段對比研究了此2種碳點的粒徑分布、元素組成以及表面基團等，討論了導致光學性質差異的可能原因。并進一步對比研究了4種烏頭酸基碳點的離子響應特性，實驗結果顯示了碳點表面基團的不同，同時也說明此類碳點具備作為熒光納米探針的潛力。細胞毒性實驗則顯示，所制備的烏頭酸基碳點具有良好的生物相容性，并成功用于細胞染色，尤其是黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs，初步顯示了其具備細胞核染色的能力。