游雪嬌，袁必鋒，馮鈺锜

(武漢大學 化學與分子科學學院，生物醫(yī)學分析化學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430072)

核酸表觀遺傳修飾能調(diào)控真核生物的基因表達，對遺傳、生長和疾病發(fā)生等方面有重要影響[1-2]。近年來，RNA表觀遺傳修飾研究取得了很大進展[3]。天然存在的RNA分子含有各種化學修飾。目前在RNA分子中共鑒定了150多個結(jié)構(gòu)不同的修飾類型[4]。

幾乎所有類型的RNA中均含有修飾。目前在轉(zhuǎn)運RNA(Transfer RNA，tRNA)上發(fā)現(xiàn)的修飾種類最多[5]。核糖體RNA(Ribosomal RNA，rRNA)是細胞中含量最豐富的RNA，也含有許多位于不同序列和結(jié)構(gòu)上的修飾類型[6]。除了在這些豐富的非編碼RNA(Non-coding RNA，ncRNA)中發(fā)現(xiàn)多種修飾外[7]，近年來研究者在體內(nèi)豐度較低的RNA類型中也發(fā)現(xiàn)越來越多的修飾，包括信使RNA(Messenger RNA，mRNA)[8]、小核RNA(Small nuclear RNA，snRNA)[9]、核仁小RNA[9]和微小RNA(microRNA，miRNA)[10-11]等。甚至環(huán)狀RNA中也存在RNA修飾，如N6-Methyladenosine(m6A)[12]。研究表明RNA修飾在真核生物的生命調(diào)控中發(fā)揮了重要作用[13]。然而，由于缺乏合適的檢測方法，目前對很多RNA修飾，特別是對低豐度的RNA修飾的功能了解甚少[14]。闡明RNA修飾的生物學意義需要能特異性檢測、量化修飾核苷并對其分布進行定位的高靈敏度分析工具。近幾年，用于RNA修飾量化和定位的分析方法已取得了很大進展。

RNA修飾的分析方法主要分為RNA修飾的全分析和定位分析兩大類。本文總結(jié)了這兩類分析方法的最新進展，并討論了其優(yōu)點和不足。通過了解每種分析方法的特性，研究人員可以選擇合適的分析方法。此外，隨著技術(shù)的進步，更多新的RNA修飾會被發(fā)現(xiàn)，RNA修飾的生理功能會被進一步認識。

1 RNA修飾的全分析

用于RNA修飾全分析的方法主要包括毛細管電泳(CE)、液相色譜(LC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、薄層色譜(TLC)、熒光標記和免疫檢測等方法(圖1)。RNA修飾的全分析需要酶/化學處理釋放RNA組分，例如核苷酸、核苷或核酸堿基，隨后采用各種分析方法進行檢測。

圖1 RNA修飾全分析方法示意圖Fig.1 Schematic diagram of methods for the global detection of RNA modifications

1.1 毛細管電泳法

毛細管電泳是一類以毛細管為分離介質(zhì)、以高壓直流電場為驅(qū)動力的分離技術(shù)，其原理是基于電場中帶電粒子的分離，可與紫外檢測、質(zhì)譜檢測和激光誘導(dǎo)熒光檢測等技術(shù)耦合。

研究表明尿液樣品中的修飾核苷可作為潛在的癌癥生物標志物。Jiang等[15]開發(fā)了毛細管電泳結(jié)合紫外檢測技術(shù)分離和定量尿樣中包括修飾核苷在內(nèi)的10種核苷，檢測限(LODs)小于2.0 μmol/L。與以往的研究相比，該方法更簡單、快速，可用于尿樣中修飾核苷的量化。最近，Stephen等[16]提出了一種使用毛細管電泳結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光(CE-LIF)分析腺嘌呤核苷(Adenosine，A)和次黃嘌呤核苷(Inosine，I)的方法。首先使用2，4，6-三硝基苯磺酸衍生A和I，得到三硝基苯基的熒光絡(luò)合物TNP-A和TNP-I。TNP-A和TNP-I進一步與γ-環(huán)糊精形成配合物，熒光增強約25倍，最后通過CE-LIF進行檢測分析。該法可同時分析和定量大鼠前腦樣品中的A和I，LODs分別為1.6、4 μmol/L。此外，Khan等[17]報道了一種毛細管電泳結(jié)合質(zhì)譜(CE-MS)直接分析生物樣品中miRNA的方法。通過CE-MS方法，不僅能夠檢測到從B細胞慢性淋巴細胞白血病血清中分離的兩種內(nèi)源性的循環(huán)miRNA(iso-miR-16-5p和miR-21-5p)，而且能夠?qū)崿F(xiàn)miRNA修飾的無標記定量。已有研究表明miRNA的序列和內(nèi)容與某些癌癥有關(guān)[18]，說明CE-MS方法分析miRNA具有臨床診斷的多功能生物檢測的應(yīng)用潛力。

雖然CE方法可快速分離分析物，且能提供良好的分離度，但穩(wěn)定性和重現(xiàn)性欠缺。此外，CE方法的樣品上樣量有限，限制了其靈敏度，有待進一步改進。

1.2 液相色譜法

液相色譜技術(shù)發(fā)展比較成熟，被普遍應(yīng)用于核酸修飾的分析。通過液相色譜技術(shù)檢測RNA修飾的方法是基于酶或化學水解產(chǎn)生的RNA組分的色譜分離。若液相色譜對不同的RNA組分無法進行有效分離，會造成無法對RNA修飾進行定性分析。因此，基線分離對基于液相色譜的分析方法至關(guān)重要。

基于液相色譜的方法常用于核苷的早期研究。Desrosiers等[19]使用二乙氨乙基纖維素色譜法結(jié)合放射性同位素標記研究來自Novikoff肝癌細胞mRNA中的甲基化。同位素標記的RNA被完全酶解成核苷后，通過液相色譜分析RNA中甲基化修飾核苷的組成，并與標準品比對，鑒定了mRNA中存在的4種2’-O-甲基核苷，分別為2’-O-Methyladenosine(Am)、2’-O-Methylguanosine(Gm)、2’-O-Methylcytidine(Cm)和2’-O-Methyluridine(Um)。此外，還在mRNA上發(fā)現(xiàn)了m6A。Buck等[20]采用高效液相色譜結(jié)合紫外檢測(HPLC-UV)對鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌(E.coli)tRNA中的29個修飾核苷進行了分析。該方法快速、靈敏且色譜分辨率高。Gehrke等[21]系統(tǒng)地介紹了用于分析RNA核苷組成的HPLC-UV方法，并開發(fā)了3種優(yōu)化的反相液相色譜系統(tǒng)，其在分辨率、分析速度和靈敏度上均有改善。優(yōu)化的方法可從約1 μg tRNA中定量31種不同的核苷，且檢測的相對誤差均小于5%。

基于液相色譜的方法操作簡單、重復(fù)性好，能用于RNA修飾的定量分析，但其定性能力較弱。為提高對RNA修飾的定性分析能力，液相色譜常與定性能力較好的質(zhì)譜聯(lián)用，從而實現(xiàn)對RNA修飾的準確定性和定量分析，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法也是目前RNA修飾全分析的主要研究方法。

1.3 質(zhì)譜分析法

質(zhì)譜分析通過測定分子質(zhì)荷比實現(xiàn)對樣品的分析。與正常核苷相比，幾乎所有的修飾核苷均有相對分子質(zhì)量上的增加，因此可運用質(zhì)譜鑒定和表征修飾核苷[22]。質(zhì)譜分析法已被廣泛用于核酸堿基、核苷和核苷酸的研究[23-27]。在近10多年中，基于質(zhì)譜的分析方法和軟件開發(fā)取得了很大進展，能提供有關(guān)RNA修飾的定性和定量信息?；谫|(zhì)譜的分析方法已被證明是用于發(fā)現(xiàn)和鑒定新的RNA修飾最有力的工具之一[28-29]。

1.3.1液相色譜-質(zhì)譜分析法由于良好的選擇性和靈敏度，LC-MS被廣泛用于化合物的定性和定量分析[30-35]?；贚C-MS的方法主要是在核苷水平上對RNA修飾進行研究，因此在分析前需將待測的核酸樣品酶解為核苷[36-41]。修飾核苷的鑒定通?；谂c標準品的比對或與RNA修飾數(shù)據(jù)庫的比對。

Zhao等[42]開發(fā)了一種超高效液相色譜(UHPLC)與飛行時間質(zhì)譜(Time-of-flight mass spectrometry)聯(lián)用的方法分析尿液中含有順式二羥基結(jié)構(gòu)的核苷和其他代謝物。與HPLC相比，UHPLC的分辨率和靈敏度更高，能檢測到更多潛在的修飾核苷。Chan等[43]使用LC-MS分析了牛分枝桿菌BCG(Bacille Calmette-Guérin)tRNA中的修飾核苷，將目標tRNA酶解成核苷，再通過多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式的LC-MS進行分析。通過與標準品比對鑒定了12個修飾核苷；并與RNA修飾數(shù)據(jù)庫比對，進一步鑒定了5個修飾核苷。Su等[44]提出了LC-MS結(jié)合動態(tài)MRM模式定量分析tRNA中修飾核苷的方法。該方法用HPLC對tRNA進行純化后，再用反相HPLC分離酶解的核苷，最后通過動態(tài)MRM模式的LC-MS對單個核苷進行鑒定和定量。該方法可在15 min內(nèi)實現(xiàn)對數(shù)微克tRNA中修飾核苷的相對定量分析。Magana等[45]通過液相色譜-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法研究了CuO納米顆粒對L.sativum中核酸甲基化的影響。通過將在電噴霧離子化中形成的質(zhì)子結(jié)合的二聚體作為MRM定量的前體離子來增強對含胞嘧啶的核苷的選擇性。該研究在DNA和RNA中分別發(fā)現(xiàn)了13.03%和0.92%的甲基化胞嘧啶。

最近，本課題組建立了一種通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)定量分析單細胞中DNA和RNA甲基化的方法[46]。筆者首先建立了一個高效的循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumor cells，CTCs)捕獲系統(tǒng)，之后在離心管中完成CTCs裂解、核酸酶解、核苷提取一系列步驟，最后通過LC-ESI-MS/MS進行分析。該方法實現(xiàn)了在單細胞水平上檢測5-Methylcytidine(5-mrC)、m6A和5-Methyl-2’-deoxycytidine(5-mdC)。

為進一步提高修飾核苷的檢測靈敏度，特別是低豐度的修飾核苷，需對樣品前處理過程進行優(yōu)化[47-48]。本課題組制備了毛細管整體柱，并將其作為在線固相微萃取柱(SPME)，建立了一種在線SPME-LC-MS/MS分析修飾核苷的方法[49-50]。結(jié)果顯示，所制備的毛細管整體柱對含有順式二羥基結(jié)構(gòu)的化合物具有優(yōu)異的選擇性，能成功用于人體尿液中含有順式二羥基結(jié)構(gòu)的修飾核苷類化合物和核糖類代謝物的系統(tǒng)分析。運用此方法對比了健康人和癌癥患者尿液中含順式二羥基結(jié)構(gòu)的修飾核苷的相對含量，發(fā)現(xiàn)了幾種潛在的癌癥生物標志物，從而為癌癥生物標志物的發(fā)現(xiàn)提供了一個很好的分析平臺[51-52]。

1.3.2穩(wěn)定同位素標記-質(zhì)譜分析法質(zhì)譜信號波動或基質(zhì)效應(yīng)常引起定量不準確，可采用穩(wěn)定同位素標記的核苷作為內(nèi)標來校正，以改善定量分析的準確性。Dalluge等[53]使用同位素稀釋結(jié)合LC-MS定量分析RNA中的二氫尿嘧啶(Dihydrouridine)修飾。首先將RNA樣品酶解成核苷，然后加入[1，3-15N2]-二氫尿嘧啶([1，3-15N2]-Dihydrouridine)和[1，3-15N2]-尿嘧啶([1，3-15N2]-Uridine)作為內(nèi)標，最后通過選擇離子監(jiān)測模式的LC-MS對標記和未標記的核苷的質(zhì)子化分子離子進行分析。

然而許多修飾核苷尚無商品化的穩(wěn)定同位素標記的標準品[28]。為了解決此問題，Deft等[28]采用代謝標記的方法獲得穩(wěn)定同位素標記的修飾核苷，并將其用作參考標準，通過非靶向液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜(LC-MS/HRMS)對修飾核苷進行檢測。該方法使用在含有D-[13C6]-葡萄糖和氨基酸的培養(yǎng)基中生長的重標記和未標記的大腸桿菌分別飼喂秀麗隱桿線蟲(C.elegans)幼蟲。從標記的或未標記的C.elegans中分離總RNA，并進行LC-MS/HRMS分析。分別鑒定出C.elegans大RNA片段(大于200 nt)中的21個修飾和小RNA片段(小于200 nt)中的26個修飾，并發(fā)現(xiàn)一些RNA修飾對環(huán)境脅迫具有動態(tài)響應(yīng)。Huber等[54]則建立了一種雙穩(wěn)定同位素標記結(jié)合LC-MS/HRMS分析RNA修飾的方法，采用含穩(wěn)定同位素標記的[甲基-13CD3]-L-甲硫氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)人類HEK293T細胞，以代謝產(chǎn)生RNA中13CD3標記的5-mrC及其氧化衍生物；用含有未標記的L-甲硫氨酸和[1，3-15N2]-胞嘧啶苷([1，3-15N2]-Cytidine)的培養(yǎng)基培養(yǎng)人類HEK293T細胞，以代謝產(chǎn)生RNA中15N2標記的5-mrC及其氧化衍生物。隨后對酶解產(chǎn)生的核苷進行LC-MS分析。該方法成功在哺乳動物的RNA中發(fā)現(xiàn)了5-mrC的第2個氧化衍生物2’-O-Methyl-5-hydroxymethylcytidine(hm5Cm)，并定量了其在高等生物體內(nèi)的含量。

1.3.3化學標記-質(zhì)譜分析法不同類型的RNA中修飾的類型不同，且修飾的豐度也不同。生物體內(nèi)許多RNA修飾的豐度均較低，傳統(tǒng)的LC-MS難以實現(xiàn)對低豐度RNA修飾的靈敏檢測。為提高對分析物的檢測靈敏度，研究者建立了化學標記結(jié)合LC-MS的分析方法[30-31，55-59]。Wrobel等[60]提出了一種基于化學標記結(jié)合高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)高靈敏分析甲基化胞苷和其他核糖核苷的方法，通過在順式二羥基核糖基團、六價Os(K2OsO2(OH)4)和四甲基乙二胺之間形成三元復(fù)合物使核糖殘基標記上六價Os后，再采用HPLC-ICP-MS檢測分析Os標記的核苷。該方法實現(xiàn)了對Cytidine(C)、Uridine(U)、5-mrC、Guanosine(G)的高靈敏分析。當進樣量為100 μL時，上述4種核苷的LODs分別為24、38、21、28 pmol/L。

本課題組建立了一種氧化衍生化結(jié)合LC-MS的新方法檢測DNA和RNA中的5-Hydroxymethylcytosine(5-hmC)和5-Formylcytosine(5-foC)[61]。該方法用MnO2將5-hmC氧化為5-foC，5-foC進一步用丹磺酰肼標記。由于丹磺酰肼上的酰肼基團易與5-foC上的醛基反應(yīng)，生成含有易帶電的叔胺基團的腙衍生物，該衍生基團能夠提高5-foC的電離效率，進而提高了LC-ESI-MS/MS檢測5-foC的靈敏度。使用該方法發(fā)現(xiàn)了哺乳動物的RNA中存在5-foC。本課題組還建立了化學標記結(jié)合LC-MS同時測定RNA中5-Methylcytosine(5-mC)、5-hmC、5-foC和5-Carboxylcytosine(5-caC)的方法[62-63]，通過使用2-溴-1-(4-二乙基氨基苯基)-乙酮標記RNA修飾，檢測靈敏度增加了70～313倍。通過此方法，除了在哺乳動物RNA中檢出5-caC外，還發(fā)現(xiàn)人的結(jié)直腸癌和肝癌組織中5-hmC含量明顯低于癌旁組織(正常組織)，表明RNA中的5-hmC可能參與了腫瘤形成和發(fā)展過程的調(diào)控。

此外，使用吉拉德P試劑標記核酸修飾，本課題組還建立了化學標記結(jié)合SPME-UHPLC-ESI-MS/MS法同時靈敏檢測DNA和RNA中的6種甲?；塑眨?-Formyl-2’-deoxycytidine(5-fodC)、5-Formylcytidine(5-forC)、5-Formyl-2’-deoxyuridine(5-fodU)、5-Formyluridine(5-forU)、2’-O-Methyl-5-formylcytidine(5-forCm)和2’-O-Methyl-5-formyluridine(5-forUm)[64]。該方法對核苷的檢測靈敏度提高了307～884倍，并在人的細胞和組織中檢測到5-forU、5-forCm和5-forUm。

1.3.4離子遷移譜-質(zhì)譜分析法傳統(tǒng)的定性和定量RNA修飾的分析方法依賴于液相色譜和毛細管電泳來減少背景，在分析前需進行RNA酶解產(chǎn)物的分離[65]。為簡化分析過程，F(xiàn)abris等[66]提出了離子遷移譜-質(zhì)譜法(IMS-MS)對核糖核苷酸混合物進行直接分析。基于IMS-MS的方法提供了一個額外的分離維度，以便根據(jù)遷移率和碎片特征區(qū)分分析物。使用IMS-MS，F(xiàn)abris等成功分析了相似或相同元素組成的核苷酸混合物[66]，并繪制了不同細胞類型和代謝狀態(tài)的核苷酸修飾譜圖[65]，為探索修飾的生物學意義提供了有價值的信息。

1.4 薄層色譜法(TLC)

TLC用于分析核苷酸、核苷和堿基已有半個多世紀的歷史?；赥LC分析RNA修飾是通過對比相應(yīng)的對照物的遷移率進行定性，通過測定斑點強度進行定量。TLC分離可在一維或二維(Two-dimensional thin layer chromatography，2D-TLC)中進行，后者可以提供更好的分離度，已被廣泛用于分析各種RNA的修飾[67-68]。由于TLC的方法靈敏度較低，因此需要結(jié)合放射性同位素(如32P)標記，通過放射自顯影檢測提高其靈敏度。通常用核糖核酸酶A(Ribonuclease A，RNase A)或RNase T1、RNase T2將RNA酶切成寡核苷酸，再通過T4多核苷酸激酶用[γ32P]ATP標記寡核苷酸的5’末端后，使用RNase P1將標記的寡核苷酸酶解為核苷酸單磷酸，最后采用TLC分析32P標記的核苷酸單磷酸。Zhong等[69]使用32P標記的2D-TLC方法在擬南芥mRNA中鑒定了m6A，且證明m6A的含量與文獻報道的動物細胞中含量相似。TLC方法分析RNA修飾，其特點是成本低、裝置簡單、無需昂貴儀器、能實現(xiàn)快速分離，但由于其分析過程較繁瑣、涉及放射性標記、準確性有限，因此常用于定性研究。

1.5 熒光標記法

除了化學標記外，熒光標記也能提高RNA修飾的檢測靈敏度。Cornelius等[70]使用BODIPY FL EDA標記核糖核苷酸的5’-單磷酸，開發(fā)了一種靈敏分析RNA組分的CE-LIF方法。RNA或寡核糖核苷酸被RNase P1酶解成核苷酸后，通過CE-LIF檢測熒光標記的BODIPY偶聯(lián)物。使用該方法檢測并鑒定了果蠅、人肝、人腎和釀酒酵母RNA中的修飾核苷，包括I、Xanthosine(X)、Pseudouridine(Ψ)和Am，LODs為80～200 pmol/L。該研究表明使用BODIPY FL EDA熒光標記核苷酸結(jié)合CE-LIF檢測具有高精確度和高靈敏度測定RNA組成的潛力。為提高液相色譜檢測DNA甲基化的分析靈敏度，Torres等[71]開發(fā)了一種使用2-溴苯乙酮選擇性衍生化胞嘧啶并結(jié)合反相HPLC熒光分光光度法檢測DNA甲基化的方法，也適用于RNA甲基化修飾的測定。采用2-溴苯乙酮標記后，5-mrC的LOD可達16.6 fmol，與LC-MS方法相當。使用該方法，Barrientos等[72]分析了L.sativumRNA中的總體甲基化水平，并進一步評估了Cd(Ⅱ)和Se(Ⅳ)脅迫對L.sativumRNA甲基化的影響。

1.6 免疫檢測法

免疫檢測法的基本原理是抗體-抗原的特異性結(jié)合。1992年，Reynaud等[73]利用單克隆抗體檢測了尿液中5-mrC、N4-Acetylcytidine(ac4C)、1-Methylinosine(m1I)、1-Methyladenosine(m1A)、7-Methylguanosine(m7G)和Ψ 6種修飾核苷。通過特異性的單克隆抗體對修飾核苷進行定性分析；通過競爭性的固相酶聯(lián)免疫測定法進行定量分析。使用這種基于免疫的方法，尿液無需處理可直接分析，且修飾核苷的檢測靈敏度在pmol范圍內(nèi)。使用相同的免疫學方法，Sasco等[74]對68例乳腺癌患者尿液中的這6種修飾核苷進行了評估，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者尿液中的m1I和m1A顯著高于正常人。Miao等[75]建立了使用斑點雜交技術(shù)分析RNA羥甲基修飾的方法，提出5-hmC存在于小鼠大腦組織的RNA中，并發(fā)現(xiàn)其在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶誘導(dǎo)的帕金森疾病小鼠模型中含量降低，暗示RNA中的5-hmC在神經(jīng)系統(tǒng)疾病上可能發(fā)揮著與DNA中的5-hmC相似的作用。Fakruddin等[76]通過基于免疫的檢測方法證明了Cdk5rap1 酶介導(dǎo)的修飾核苷2-Methylthio-N6-isopentenyladenosine(ms2i6A)只存在線粒體tRNA中，而不存在于細胞核RNA中。

基于免疫的檢測方法簡化了樣品前處理過程，縮短了樣品前處理時間，但抗體的高度特異性是此方法用于準確分析修飾核苷的前提條件。

2 RNA修飾的定位分析

前述的RNA修飾全分析只能提供RNA修飾的整體含量信息，不能提供相關(guān)的序列位點信息。RNA修飾的定位分析對于了解其生物學功能至關(guān)重要。測序技術(shù)的進步，特別是高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，加速了RNA修飾的全轉(zhuǎn)錄組分布的研究。目前已經(jīng)建立了多種用于系統(tǒng)分析RNA修飾位置的方法，包括核酸內(nèi)切酶酶解法、基于質(zhì)譜分析的方法以及基于測序的方法等。

2.1 核酸內(nèi)切酶酶解法

限制性核酸內(nèi)切酶方法的原理是基于一些特殊的酶能特異性識別特定的RNA修飾。因此，通過某些核酸內(nèi)切酶酶解的模式結(jié)合凝膠電泳、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)、TLC和MS等檢測方法能實現(xiàn)RNA修飾的定位分析。

Morse等[77]利用乙二醛處理結(jié)合RNase T1酶解，開發(fā)了一種通過特異性酶解結(jié)合PCR擴增定位RNA中I修飾的方法。首先用乙二醛處理RNA，乙二醛能同時與G和I反應(yīng)，但只有G能與乙二醛形成穩(wěn)定的加合物，且能進一步與硼酸鹽形成更穩(wěn)定的復(fù)合物。隨后使用RNase T1酶解乙二醛化的RNA，G-乙二醛-硼酸鹽復(fù)合物對RNase T1酶解具有抗性，因此RNase T1能特異性切割I(lǐng)位點。最后通過RT-PCR進一步分析由RNase T1酶解產(chǎn)生的含I的片段。使用此方法，在小鼠大腦mRNA中鑒定了兩個已知的A至I的編輯位點，提供了這些位點I存在的直接證據(jù)。該方法可以促進RNA中I的定位分析，也為鑒定新的脫氨酶底物提供了一種新方法。Yu等[78]提出了一種基于RNase H酶解準確靈敏定位RNA中2’-O-甲基化修飾的方法。使用此方法鑒定出兩個2’-O-甲基化修飾位點，分別為非洲爪蟾18S rRNA中的G1448和非洲爪蟾28S rRNA中的A394位點。此外，還能利用RNase H的位點特異性切割結(jié)合[γ-32P]ATP 標記的TLC方法對Ψ修飾進行定位分析[79]。此方法不僅能確定RNA中是否含有Ψ修飾，還能確定Ψ修飾的位點。

利用核酸內(nèi)切酶酶解對RNA修飾進行定位分析需先將待研究的某一種RNA進行分離，因此該類方法不適用于對豐度很低的 mRNA 或者長非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)上修飾的研究。芝加哥大學的 Pan 研究組開發(fā)了一種在單核苷酸分辨率下確定mRNA和lncRNA中m6A修飾位置的新方法[80]。該方法將傳統(tǒng)的RNase H位點特異性酶切與連接酶連接法相結(jié)合(SCARLET)，利用SCARLET方法無需提前進行RNA純化便可實現(xiàn)對待研究RNA的分離。該方法能精確確定mRNA/lncRNA中m6A修飾狀態(tài)，且操作簡單、無需復(fù)雜儀器，為研究人員提供了一個快速、有效檢測RNA修飾的平臺。

2.2 質(zhì)譜分析法

近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展以及數(shù)據(jù)分析軟件的開發(fā)，質(zhì)譜技術(shù)在生物大分子研究方面得到了很好的應(yīng)用。近10年來，質(zhì)譜在RNA研究方面取得了顯著的進展，研究人員開發(fā)了一系列用于RNA修飾定位分析和RNA序列分析的方法(圖2)[81]。

2.2.1基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜分析法2000年，Kirpekar等[82]建立了基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)用于5S rRNA序列分析以及其中修飾的定位分析。使用特異性酶酶解RNA產(chǎn)生寡核糖核苷酸片段后，通過MALDI-MS直接分析寡核糖核苷酸片段。通過比較實驗獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與從基因序列預(yù)測的數(shù)據(jù)來鑒定帶有修飾的寡核糖核苷酸片段。為了更快速、靈敏、精確地繪制RNA修飾譜圖，采用兩種RNase同時酶解RNA，在3種細菌的5S rRNA中成功定位了甲基化胞嘧啶。隨后該研究組建立了一系列用于定位RNA修飾的MALDI-MS/MS方法[83-84]。該方法靈敏度高、對雜質(zhì)的耐受性好，適用于引物延伸或色譜分析技術(shù)不適用的情況。

2.2.2液相色譜-質(zhì)譜分析法基于LC-MS的方法用于RNA修飾定位分析，通常需RNase酶解以獲得RNA短片段[29]。對相應(yīng)的寡核糖核苷酸片段進行LC-MS/MS分析，可得到確切的堿基組成和序列信息，通過與基因序列數(shù)據(jù)比對能確定RNA片段上修飾的序列位點。McCloskey課題組在1993年建立了一種LC-ESI-MS方法用于RNA修飾的定位分析[85]，成功定位了E.coli23S rRNA中的3-Methylpseudouridine(m3Ψ)[86]，超嗜熱古細菌P.occultum5S rRNA中的ac4C和N4-acetyl-2’-O-methylcytidine(ac4Cm)[87]，以及E.colitmRNA中的5-Methyluridine(m5U)和Ψ[88]等。

為提高檢測靈敏度和改善RNA修飾片段的覆蓋度，Cao等[89]通過LC-MS/MS開發(fā)了質(zhì)量排除列表方法用于RNA修飾譜圖的建立。通過質(zhì)量排除列表去除未修飾的序列，只分析含有修飾的酶解產(chǎn)物以產(chǎn)生MS/MS譜圖。結(jié)果顯示，基于DNA的排除列表可檢測的RNA修飾酶解產(chǎn)物的數(shù)量增加約20%，從而有效擴大了酶解產(chǎn)物的MS/MS覆蓋范圍，簡化了LC-MS/MS譜圖。Yamauchi等[90]開發(fā)了一種基于MS直接測定RNA中Ψ修飾的方法。通過精確測量由碰撞誘導(dǎo)解離質(zhì)譜產(chǎn)生的特征性雙脫水核苷陰離子([C9H7N2O4]1-，m/z207.04)來確定含Ψ的RNA片段，使用Pseudo-MS3確定含Ψ的核苷酸序列。采用此方法鑒定了人類剪接體snRNA中所有已知的Ψ位點，并在U5和U6 snRNA中新發(fā)現(xiàn)了兩個Ψ位點。

圖2 基于質(zhì)譜分析的RNA修飾定位分析方法示意圖[81]Fig.2 Schematic diagram of methods for the MS-based location analysis of RNA modifications[81]

2.2.3Top-down質(zhì)譜分析法大多數(shù)基于MS方法的研究對象僅限于RNA寡核苷酸片段，難以獲得完整的RNA片段分析。采用Top-down質(zhì)譜分析法可解決此問題。該方法無需使用核酸酶酶解，避免了繁瑣的酶切和寡核糖核苷酸的分離步驟。通過結(jié)合高分辨質(zhì)譜儀與多種核糖核苷酸的碎裂方式，如電子脫離解離(EDD)、碰撞活化解離(CAD)、碰撞誘導(dǎo)解離(CID)等，可對完整的RNA分子直接進行質(zhì)譜分析，能提供RNA的序列信息，并能對RNA轉(zhuǎn)錄后修飾進行鑒定、相對定量和定位分析[81，91]。

2009年，McLuckey等[92]通過離子阱CID的碎裂方式實現(xiàn)了tRNA的Top-down質(zhì)譜分析，序列覆蓋率達60%。此方法減少了光譜重疊和電荷態(tài)模糊的產(chǎn)生，簡化了產(chǎn)物離子譜的解譜過程，更易于產(chǎn)物離子的鑒定。由于U到Ψ的轉(zhuǎn)化未發(fā)生相對分子質(zhì)量變化，因此通過對RNA或其片段的簡單質(zhì)譜分析無法區(qū)分異構(gòu)體U和Ψ。根據(jù)CAD解離RNA時U(N-糖苷鍵)和Ψ(C-糖苷鍵)的不同碎裂行為，Taucher等[93]將Top-down質(zhì)譜分析法用于RNA中Ψ修飾的定位分析。然而，此方法只能用于標準RNA樣品中Ψ的分析，對于實際樣品中Ψ的分析尚需進一步改善。2012年，Breuker實驗室[94]建立了結(jié)合EDD與CAD 兩種碎裂方式的Top-down質(zhì)譜分析法鑒定了RNA修飾的類型和位置。該法對22 nt和34 nt長度的RNA分析的覆蓋率分別為100%和97%，對轉(zhuǎn)錄后高度修飾的tRNA 分析的覆蓋率亦可達到 89% 以上。這表明結(jié)合多種解離數(shù)據(jù)可以提供用于分析RNA修飾的更廣泛的序列信息，能更加精確地確定修飾的類型和位置。近期，Glasner等[91]使用類似的方法實現(xiàn)了對RNA中異構(gòu)體或非異構(gòu)形式的甲基化修飾(m6A，5-mrC，m5U和3-Methyluridine(m3U))的相對定量和直接定位分析。

盡管Top-down質(zhì)譜分析法對于儀器和樣品的要求很高，但其諸多優(yōu)點使之成為RNA修飾研究中頗有前景的方法之一[91]。

2.2.4穩(wěn)定同位素標記-質(zhì)譜分析法代謝組學中的穩(wěn)定同位素標記法也可用于RNA修飾研究中。Li等[95]提出了一種基于兩個RNA樣本的差異標記的RNA酶解物比較分析法(Comparative analysis of RNA digests，CARD)，實現(xiàn)了對RNA修飾的簡單快速定位。在RNase T1酶解RNA過程中，使用16O標記參考RNA樣品(已知其完整序列及修飾信息)，18O標記待測RNA樣品(其序列及修飾信息未知)。通過組合兩個酶解物進行LC-MS分析，當參考物和待測物之間共享相同序列或轉(zhuǎn)錄后修飾時，將顯示為以2 Da分開的二重聯(lián)物；當兩者之間的序列或修飾有差異時，將產(chǎn)生可用于進一步表征的序列。通過直接比較待測RNA與參考RNA的序列和修飾信息可鑒定RNA修飾的序列特異性差異。Li等[96]應(yīng)用CARD方法對E.coli的tRNA進行了序列分析。然而，由于RNase酶解后的tRNA樣品中存在天然同位素13C和15N引起的譜圖卷積，使得數(shù)據(jù)分析具有挑戰(zhàn)性。為解決此問題，Wetzel等[97]通過使用富含12C不含13C的培養(yǎng)基，顯著降低了在CARD實驗過程的同位素效應(yīng)，使tRNA酶解產(chǎn)物的檢測得到了35%的改善。Taoka等[98]提出了穩(wěn)定同位素標記結(jié)合LC-MS的分析方法，用于RNA轉(zhuǎn)錄后修飾的系統(tǒng)檢測。該方法將體外轉(zhuǎn)錄的重同位素標記的參考RNA等量摻入樣品RNA溶液中，使用RNase酶解混合物后進行LC-MS分析。通過分析保留時間的移位和MS信號定量檢測轉(zhuǎn)錄后修飾的寡核苷酸；通過檢測僅包含輕鏈片段的色譜峰鑒定修飾位點。利用這種方法，在粟酒裂殖酵母的rRNA中鑒定了122個修飾位點，并獲得單核苷酸分辨率的真核生物rRNA轉(zhuǎn)錄后修飾譜圖。隨后Taoka研究小組[99]運用該法研究了釀酒酵母rRNA的完整化學結(jié)構(gòu)，并在25S rRNA中第2 345位檢測到以前未發(fā)現(xiàn)的Ψ。

這種以穩(wěn)定同位素標記為基礎(chǔ)的LC-MS方法已被證明是一種有價值的工具，被廣泛用于不同RNA種類的修飾研究。

2.2.5化學標記-質(zhì)譜分析法由于有些轉(zhuǎn)錄后修飾核苷(例如Ψ)與正常核苷相比相對分子質(zhì)量不變，因此采用正常的MS分析方法無法實現(xiàn)對這種特定修飾的檢測。為解決此問題，Patteson等[100]開發(fā)了一種化學標記結(jié)合MALDI-MS對RNA中Ψ修飾進行定位分析的方法。該方法利用N-環(huán)己基-N’-(2-嗎啉乙基)碳二亞胺對甲苯磺酸鹽(CMC)選擇性標記Ψ，通過比較標記前后的質(zhì)譜圖可在完整的RNA中鑒定Ψ及其個數(shù)；進一步對RNase T1酶切產(chǎn)物進行MALDI-MS分析，能確定Ψ修飾的序列位置。該方法能直接測定RNA中的Ψ修飾，還可與其他定位方法聯(lián)用以完全表征存在于RNA中的轉(zhuǎn)錄后修飾。此外，Mengel-Jorgensen等[101]使用類似的化學標記質(zhì)譜法分析了tRNA中的Ψ修飾和其他修飾。該方法首先使用丙烯腈將tRNA氰乙基化，隨后用RNase A或RNase T1酶解tRNA以進行MALDI-MS分析。氰乙基化的寡核苷酸會產(chǎn)生1個53.0 Da的質(zhì)量增加，通過比較未處理和丙烯腈處理的樣品的質(zhì)譜圖可以確定Ψ修飾的位點。使用該方法，成功地在E.coli的tRNATyrII中鑒定了1個4-Thiouridine(s4U)位點和1個Ψ位點。

2.3 高通量測序分析法

近年來，高通量測序技術(shù)的進步極大地推動了表觀轉(zhuǎn)錄組學領(lǐng)域的發(fā)展。基于高通量測序技術(shù)的分析方法是目前定位分析RNA修飾的重要方法(圖3)。

2.3.1逆轉(zhuǎn)錄-測序分析當RNA中修飾的堿基影響Watson-Crick堿基互補配對時，會導(dǎo)致該修飾位點的逆轉(zhuǎn)錄停止或非互補性堿基的錯誤摻入[102]。通過高通量測序?qū)τ纱水a(chǎn)生的提前終止的互補脫氧核糖核酸(Complementary DNA，cDNA)或含錯配堿基的cDNA進行分析，可以提供全面的RNA修飾的位置信息。

RNA中普遍存在的A至I的編輯在轉(zhuǎn)錄組中發(fā)揮著重要作用[103]。已知I在逆轉(zhuǎn)錄過程中會與C發(fā)生錯配，在后續(xù)的測序中該位點以G作為輸出信號，通過與基因組DNA比較，可以辨別實際基因組中突變的錯誤摻入信號[102]。Alon等[104]利用這一特性結(jié)合高通量測序并輔以生物信息學分析，系統(tǒng)地鑒定了人腦組織的成熟miRNA中的A至I編輯。通過該方法，成功鑒定了許多已知的成熟miRNA中的I編輯位點，并揭示了17個新的位點，其中12個是位于miRNA的識別位點。

m1A、1-Methylguanosine(m1G)和3-Methylcytidine(m3C)是tRNA中的普遍修飾，在tRNA的生物合成、穩(wěn)定性和功能活性中起重要作用[105]。Cozen等[105]利用這些修飾會引起逆轉(zhuǎn)錄終止的性質(zhì)在tRNA中鑒定其位點，提出了一種AlkB促進的RNA甲基化測序方法(AlkB-facilitated RNA methylation sequencing，ARM-seq)。在ARM-seq中，通過AlkB處理RNA去除m1A、m1G和m3C的甲基化修飾以獲得全長的cDNA；然而，未經(jīng)處理的RNA將產(chǎn)生提前終止的cDNA。因此，通過比較處理樣品和未處理樣品的cDNA可以鑒定RNA中的這些甲基化修飾位點。使用這種比較甲基化分析法，該研究提供了m1A、m1G和m3C的全轉(zhuǎn)錄組譜圖，并揭示了大量未曾檢測到的來源于tRNA的甲基化小RNA。

逆轉(zhuǎn)錄-測序分析法無需復(fù)雜的樣品前處理，但仍存在一些問題。RNA的多級結(jié)構(gòu)以及修飾本身的固有性質(zhì)易產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果。另外，RNA的易降解性也可能使數(shù)據(jù)分析變得復(fù)雜。因此，需要多種方法確認基于逆轉(zhuǎn)錄方法的分析結(jié)果。

圖3 基于測序分析的RNA修飾定位分析方法示意圖Fig.3 Schematic diagram of methods for the sequencing-based location analysis of RNA modifications

2.3.2化學標記-測序分析化學標記后的RNA修飾會改變其逆轉(zhuǎn)錄特征，如逆轉(zhuǎn)錄終止或逆轉(zhuǎn)錄堿基錯配。結(jié)合高通量測序，研究者開發(fā)了一系列化學標記-測序分析法用于核酸修飾的定位研究。Suzuki等[106]開發(fā)了化學標記結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄-測序的肌苷定位分析方法(Inosine chemical erasing followed by sequencing，ICE-seq)。該方法用丙烯腈處理RNA，通過邁克爾加成特異性氰乙基化肌苷形成N1-氰乙基肌苷。N1-氰乙基可以破壞I與C的Watson-Crick堿基配對，導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄終止，隨后可通過測序鑒定I。該研究確定了5 072個I編輯位點，其中包括4 395個新位點。

此外，Ψ是RNA中最豐富的修飾之一[102]。Ψ的全轉(zhuǎn)錄組位點的測定依賴于用化學試劑CMC標記Ψ，形成的CMC-Ψ加合物能導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄終止，從而實現(xiàn)Ψ的單堿基分辨率檢測。CMC可?；疪NA中G的N1位置處，U的N3位置處，以及Ψ的N1和N3位置處，在堿性條件下(pH 10.4)CMC-G和CMC-U的加合物會水解，Ψ上只保留N3位置的CMC加合物[107]。利用類似的原理，已開發(fā)了3種基于CMC標記分析Ψ修飾位點的方法，分別為Pseudo-seq[108]、Ψ-seq[109]和PSI-seq(Pseudouridine site identification sequencing)[110]。研究人員以單堿基分辨率成功鑒定了酵母mRNA中約50～100個Ψ修飾位點和人類mRNA中約100～400個Ψ修飾位點[108-110]。但上述方法不能預(yù)先富集含Ψ的RNA片段。Yi課題組[111]利用“點擊”化學開發(fā)了一種CeU-seq(N3-CMC-enriched pseudouridine sequencing)分析方法，可對含有Ψ的RNA片段預(yù)富集，能實現(xiàn)在單堿基分辨率下的Ψ檢測。在CeU-seq中，使用疊氮基化的CMC衍生物標記Ψ，借助“點擊”化學使N3-CMC-Ψ加合物與生物素偶聯(lián)，通過生物素預(yù)富集含Ψ的RNA片段并進行測序。通過CeU-seq，研究者在1 929個人類轉(zhuǎn)錄本中鑒定了2 084個Ψ修飾位點。該方法為Ψ介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控的功能研究提供了有力工具。

2.3.3化學轉(zhuǎn)化-測序分析法亞硫酸氫鹽測序法已被廣泛用于DNA中的5-mC定位分析。同樣的方法也能應(yīng)用于RNA中的5-mC定位分析，由于RNA易降解，因此需對該方法進行改良。目前，基于亞硫酸氫鹽測序的方法已被用于不同物種RNA中5-mC的定位分析，包括果蠅[112]、人類[113]、古細菌[114]、布氏錐蟲[115]和植物[116]等。

Squires等[113]將亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化與高通量測序技術(shù)相結(jié)合，在人類的mRNA和ncRNA中鑒定了10 275個5-mC位點，表明這種修飾在細胞轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中起著潛在的作用。Burgess等[116]使用RNA亞硫酸氫鹽測序法以單核苷酸分辨率鑒定了6種不同植物中3種亞細胞(細胞核、線粒體、葉綠體)轉(zhuǎn)錄組中的tRNA和rRNA的5-mC位點。但RNA的亞硫酸氫鹽測序法存在局限，需要不斷優(yōu)化實驗條件。如未修飾的胞嘧啶的不完全脫氨，可能產(chǎn)生假陽性；過度的脫氨和RNA的降解會導(dǎo)致低豐度RNA物種的覆蓋率不足[102]。此外，在該反應(yīng)條件下DNA比RNA穩(wěn)定，因此必須嚴格排除DNA的污染[102]。另外，因RNA在高pH值環(huán)境下易水解，所以需在低堿性的條件下進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。

2’-O-甲基化是rRNA上最豐富的修飾，對核糖體生物合成、mRNA選擇性和翻譯保真度至關(guān)重要。Birkedal等[117]開發(fā)了一種堿性水解結(jié)合高通量測序技術(shù)，用于定位酵母核糖體中2’-O-甲基化(Ribose methylation sequencing，RiboMeth-seq)。該方法在rRNA中不僅鑒定了已知的2’-O-甲基化修飾位點，而且發(fā)現(xiàn)了一些新的2’-O-甲基化修飾位點。隨后，Krogh等[118]將RiboMeth-seq應(yīng)用于分析HeLa細胞rRNA中的2’-O-甲基化，鑒定了包括兩個新位點在內(nèi)的106個修飾位點。此研究使用高通量測序方法繪制了人類rRNA中2’-O-甲基化修飾的譜圖，可為研究不同生理或病理環(huán)境下rRNA甲基化的作用提供平臺。

RiboMeth-seq方法能達到單堿基分辨率，且能用于甲基化率的相對定量[102]。然而，該方法僅適用于高豐度RNA，對于低豐度RNA(如mRNA)中存在的2’-O-甲基化位點的分析不適用。最近，He課題組[119]利用2’-OH和2’-O-甲基化核苷的不同化學性質(zhì)，基于氧化裂解開發(fā)了用于人類mRNA中2’-O-甲基化修飾的分析方法Nm-seq。該方法通過氧化-消除-去磷酸化的循環(huán)將RNA片段從3’端到5’端無2’-O-甲基化修飾的核苷均去除，直至暴露出2’-O-甲基化修飾的核苷。在最后一個循環(huán)中不進行去磷酸化，導(dǎo)致2’端不含修飾的核苷的3’-磷酸不能進行下一步的連接，而2’-O-甲基化修飾的核苷的3’-OH可以進一步連接3’-適配體并通過PCR擴增進行富集，隨后進行高通量測序。利用此方法在哺乳動物mRNA中發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個2’-O-甲基化位點，其中2’-O-甲基化位點主要富集在編碼序列中，并有一個高度富集的AGAUC序列特征。

2.3.4免疫沉淀-測序分析大多數(shù)RNA修飾以低豐度存在，因此在分析前有必要對含某些修飾的RNA片段進行富集?；诳贵w的親和富集通過抗體-抗原的特異性結(jié)合而實現(xiàn)。

由于缺乏區(qū)分m6A與A的化學方法，使用m6A特異性抗體預(yù)富集含m6A的RNA片段結(jié)合高通量測序可實現(xiàn)對m6A的特異性檢測。2012年，有兩個課題組基于m6A特異性抗體結(jié)合高通量測序技術(shù)建立了m6A免疫沉淀測序方法(m6A-specific methyled RNA immunoprecipitation coupled with next-generation sequencing，MeRIP-seq/m6A-seq)，生成了分辨率為100～200 nt的全轉(zhuǎn)錄組范圍的m6A譜圖[120-121]。研究顯示，源自7 000多個人類基因的轉(zhuǎn)錄本中有12 000多個m6A甲基化修飾位點，且位點一般富集在終止密碼子附近和3’非翻譯區(qū)。

除了哺乳動物，其他物種的mRNA中也廣泛存在m6A修飾。Schwartz等[122]使用MeRIP-seq在近似單核苷酸水平上鑒定了酵母減數(shù)分裂1 183個轉(zhuǎn)錄本中的1 308個m6A位點，并提出m6A在酵母減數(shù)分裂期間是一種動態(tài)調(diào)控的甲基化修飾。此外，在植物中，m6A是mRNA中一個高度保守的修飾，不僅在終止密碼子附近和3’非翻譯區(qū)內(nèi)富集，而且在起始密碼子周圍含量豐富(16%)[123]，顯示了m6A在植物基因表達中的重要調(diào)控作用。然而由于免疫沉淀的固有缺陷，MeRIP-seq/m6A-seq的方法無法在全轉(zhuǎn)錄組水平上鑒定m6A的精確位置。為實現(xiàn)m6A甲基化的單堿基分辨率檢測，基于MeRIP-seq的優(yōu)化方法被開發(fā)：在m6A-CLIP(m6A-cross-linking immunoprecipitation)方法[124]和miCLIP(m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation)方法[125]中，使用254 nm UV照射誘導(dǎo)抗體與含m6A的RNA之間形成共價交聯(lián)。在逆轉(zhuǎn)錄中，抗體-RNA交聯(lián)位點會引起cDNA突變或提前終止，可通過高通量測序以單堿基分辨率識別m6A位點。

類似地，Chen等[126]開發(fā)了PA-m6A-seq方法(Photo-crosslinking-assisted m6A sequencing)，將可以提高交聯(lián)效率的光反應(yīng)性核苷類似物s4U加入細胞培養(yǎng)基中，使之摻入新合成的RNA分子中；免疫沉淀后，在365 nm的UV照射下，抗體和含m6A的RNA之間形成共價交聯(lián)，結(jié)合的s4U可在交聯(lián)位點導(dǎo)致T到C的轉(zhuǎn)變。因此，該方法可以實現(xiàn)單堿基分辨率識別m6A修飾位點。除m6A外，m1A是RNA中另一種普遍的動態(tài)修飾。Li等[127]基于m1A能造成逆轉(zhuǎn)錄終止的固有特性，結(jié)合免疫沉淀測序開發(fā)了新技術(shù)m1A-ID-seq。利用這一技術(shù)，成功實現(xiàn)了人類細胞全轉(zhuǎn)錄組水平上m1A修飾位點的鑒定，在mRNA和ncRNA中鑒定出901個m1A位點，并發(fā)現(xiàn)m1A主要位于mRNA的5’非翻譯區(qū)。該研究揭示了m1A是哺乳動物mRNA中的一種新的、動態(tài)的、可逆的表觀轉(zhuǎn)錄組標志物，為m1A修飾參與基因表達調(diào)控的研究提供了重要工具。

Dominissini等[128]建立了m1A-seq(m1A-specific methyled RNA immunoprecipitation coupled with next-generation sequencing)方法鑒定不同真核生物mRNA中的m1A修飾。研究發(fā)現(xiàn)m1A修飾發(fā)生在真核細胞中的數(shù)千個不同基因轉(zhuǎn)錄本上。此外，Delatte等[129]利用hMeRIP-seq(Hydroxymethylated RNA immunoprecipitation followed by sequencing)方法在果蠅轉(zhuǎn)錄組中鑒定了超過3 000個5-hmC的峰，繪制了5-hmC在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的修飾譜圖，揭示了這一修飾的分布、位置和功能。研究發(fā)現(xiàn)5-hmC優(yōu)先呈現(xiàn)在聚腺苷酸化的RNA中，且RNA的羥甲基化有利于mRNA翻譯。

基于免疫沉淀的方法分析RNA修飾的位置也存在問題，如由于抗體的特異性差導(dǎo)致與其他修飾交叉反應(yīng)。因此，科研人員有必要使用兩種以上的抗體進行交叉驗證。此外，商品化的RNA修飾抗體種類較少[102]。

2.4 單分子測序

高通量技術(shù)能實現(xiàn)快速高通量的測序，但涉及樣品擴增，可能引入錯誤堿基或?qū)е聣A基修飾信息的丟失[130]。第三代測序技術(shù)無需樣品擴增，可進行單分子測序，以實現(xiàn)RNA修飾的直接定位分析，該技術(shù)包括單分子實時(Single-molecule real-time，SMRT)測序、單分子納米孔測序等。

Flusberg等[131]在2010年建立了SMRT測序進行DNA甲基化分析，通過對DNA聚合酶的工作狀態(tài)進行實時監(jiān)測，根據(jù)聚合酶對模板鏈上正常堿基和修飾堿基的不同動力學信號，可直接檢測DNA甲基化。Korlach等[132]對該方法進行了改進，通過逆轉(zhuǎn)錄結(jié)合SMRT的方法成功定位了RNA中m6A的修飾位點。將DNA 聚合酶替換為源自 HIV 的逆轉(zhuǎn)錄酶，隨后實時監(jiān)測逆轉(zhuǎn)錄酶的信號。在RT-SMRT分析中，逆轉(zhuǎn)錄酶通過m6A時的動力學信號明顯不同于對照RNA中A的動力學信號，與天然的A相比，在m6A位置的脈沖頻率明顯降低。除了m6A外，該方法也適用于許多其他修飾的定位分析。然而，SMRT對RNA修飾的定位分析目前主要用于合成的RNA，用于實際樣品的RNA修飾分析仍需進一步完善。

除了SMRT測序外，納米孔測序技術(shù)也被用于修飾核苷的單分子檢測。納米孔技術(shù)利用電壓驅(qū)動分子穿過納米孔，不同的核苷通過納米孔會產(chǎn)生不同的阻斷電流，根據(jù)阻斷電流的變化可以區(qū)分正常核苷與修飾核苷[133]。由于納米孔技術(shù)能實現(xiàn)單個核酸分子的分析，且不需對核苷酸進行標記，因此基于納米孔的技術(shù)具有分析RNA修飾的潛力。Ayub等[134]建立了使用α-溶血素納米孔識別寡核苷酸中RNA堿基的方法。通過特征化的電流監(jiān)測，實現(xiàn)了對RNA中4種核堿基(包括鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶)的區(qū)分。另外，還可區(qū)分包括I、m6A和5-mrC在內(nèi)的修飾的核堿基。2016年，英國牛津納米孔技術(shù)公司的科研人員利用一個納米孔陣列成功地將DNA納米孔測序技術(shù)拓展成RNA納米孔測序技術(shù)[135]。

納米孔測序技術(shù)是不依賴逆轉(zhuǎn)錄和PCR直接測序RNA的技術(shù)，與其他RNA測序方法相比有許多優(yōu)勢：無需擴增，不存在PCR或逆轉(zhuǎn)錄的偏倚；直接測定RNA，能檢測核苷類似物；能產(chǎn)生全長的、特定的RNA序列，對剪接變體的研究特別有用[135]。這將提高RNA分析的易用性和速度，同時產(chǎn)生更豐富的生物信息。

由于RNA分子自身易發(fā)生折疊，易高度結(jié)構(gòu)化，需在納米孔測序之前消除RNA的二級結(jié)構(gòu)，因此RNA的單分子直接測序更具挑戰(zhàn)。此外，RNA比DNA更易降解，在測序較長RNA鏈時，可能會造成分析結(jié)果的不準確。因此，還需不斷改進技術(shù)以實現(xiàn)RNA單分子測序的廣泛應(yīng)用。不難預(yù)料，單分子測序未來將成為研究RNA修飾的強有力工具。

2.5 冷凍電鏡分析

冷凍電鏡技術(shù)是應(yīng)用冷凍固定技術(shù)和透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術(shù)，能實現(xiàn)物質(zhì)在近原子水平的高分辨率上的三維立體成像，已被有效地用于生物大分子的分析。

2015年，Khatter等[136]運用冷凍電鏡技術(shù)確定了平均分辨率為3.6?的人類80S核糖體結(jié)構(gòu)，提供了核苷酸堿基的位置信息，為研究人類核糖體與抗生素的配體復(fù)合物奠定了基礎(chǔ)。最近，Natchiar等[137]使用高分辨率的單顆粒冷凍電鏡觀察到了人類80S核糖體RNA上的化學修飾，并討論了rRNA修飾位點的三維定位和結(jié)構(gòu)意義。該研究在人類80S核糖體RNA上鑒定了136個修飾位點，其中新發(fā)現(xiàn)了52 個位點，同時也有一些之前鑒定的位點消失，這可能是由于細胞類型的差異所致。為研究rRNA在藥物結(jié)合的特異性中的作用，該研究還觀察了人類核糖體與3種抑制劑相互作用時的大分子結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明rRNA存在特定的修飾位點，可作為選擇性配體相互作用的靶點，為新藥的設(shè)計和開發(fā)提供了一個新思路。此項研究是冷凍電鏡技術(shù)進入表觀轉(zhuǎn)錄組學研究的重要一步，為RNA修飾的分析提供了一種高分辨率的新方法。

3 結(jié)論與展望

分析技術(shù)的革新推動了RNA修飾研究的進展，系統(tǒng)研究這些修飾的功能將有助于增強對細胞發(fā)育過程和疾病形成等基本問題的理解。破譯RNA修飾的生物學功能需要高靈敏度、高準確度的方法，這也將促進相關(guān)技術(shù)和軟件的開發(fā)。

檢測RNA修飾的主要挑戰(zhàn)是高通量檢測方法的精度、靈敏度、定量能力和分辨率，以及待解決的諸多問題。如，目前技術(shù)的靈敏度尚有不足，無法對少量稀有樣本開展研究；無法對所有RNA修飾進行精確定量研究；無法確定1個RNA分子上不同修飾的數(shù)量；無法通過一次試驗發(fā)現(xiàn)多種不同的修飾等。對于RNA修飾的定位研究、測序深度和所使用的生物信息學軟件也會影響RNA修飾的位點分析。

未來RNA修飾的研究可從以下方面努力：①通過優(yōu)化檢測方法以實現(xiàn)單堿基分辨率并量化RNA修飾。②高通量的測序方法對于全面定位RNA修飾是必要的，但目前僅限于少數(shù)修飾的研究。③現(xiàn)有的RNA修飾測序方法不能直接應(yīng)用于單細胞，RNA修飾的單細胞測序?qū)沂綬NA修飾在細胞發(fā)育和分化過程中的作用至關(guān)重要。④不同修飾之間的豐度差異很大，因此，開發(fā)可在同一個分子上同時識別多個修飾的高通量技術(shù)將非常有用。此外，質(zhì)譜技術(shù)的進步和測序技術(shù)的革新也會促進RNA修飾的功能研究。新修飾的數(shù)目仍在增加，已知的修飾也可能發(fā)生在新的位點和不同的RNA類型中。隨著技術(shù)的不斷改進，對RNA修飾的研究將會促進對其功能的深入認識。