張 吟， 許秋霞， 黃丹丹， 張淑芬， 馬 平

無(wú)花果葉為?？崎艑僦参餆o(wú)花果(FicuscaricaL)的葉子，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化活性等作用[1-7]，而無(wú)花果葉的降血糖作用是筆者關(guān)注的重點(diǎn)。無(wú)花果在全國(guó)各地均有栽培，福建地區(qū)的資源尤為豐富。本研究以在南方地區(qū)培植較多的紫果、日本紫果、豐產(chǎn)黃、美利亞為研究對(duì)象，選擇目前評(píng)價(jià)降血糖及血脂作用較為經(jīng)典的指標(biāo)，如空腹血糖(blood glucose, GLU)、甘油三酯(triglyceride, TG)、膽固醇(total cholesterol, TC)等，比較4種品系無(wú)花果葉提取物(FicuscaricaLextracts, FCL)對(duì)1型糖尿病模型小鼠的降血糖作用，并探討FCL在肝糖異生方面的作用機(jī)制，檢測(cè)FCL對(duì)肝糖原和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G-6-Pase)水平的影響，為無(wú)花果葉優(yōu)良品種的選育提供藥效學(xué)依據(jù)，并為后期的深入研究打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 昆明小鼠60只，雄性，體質(zhì)量22～24 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供[許可證號(hào)：SYXK(滬)2012-0002，合格證號(hào)：2007000518718]。飼養(yǎng)條件：動(dòng)物房溫度為20～25 ℃，濕度為40%～70%，室內(nèi)12 h 明暗切換。

1.1.2藥材和主要試劑 無(wú)花果葉(產(chǎn)地：福建省莆田市綠陽(yáng)農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司林山無(wú)花果基地，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院馬翠蘭副教授鑒定)；FCL提取物(本課題組自制)；TG(批號(hào)：141712030)及TC測(cè)定試劑盒(批號(hào)：141612031)(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)凍干粉(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；小鼠G-6-Pase酶聯(lián)免疫分析試劑盒(批號(hào)：201303，美國(guó)Cloud-Clone公司)；肝/肌糖原測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20130319，南京建成生物有限公司)。

1.1.3主要儀器 全自動(dòng)生化分析儀(BS-300，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；臺(tái)式低速離心機(jī)(800型，上海醫(yī)療器械有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(KDC-160HR，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)；微型漩渦混勻器(VXH-3，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；ACCU-CHEK?Performa Nano血糖儀及試紙條(德國(guó)羅氏診斷有限公司)。

1.2方法

1.2.1主要試劑的配制 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mmol/L，pH為4.0～4.5)：精密稱取2.1 g檸檬酸(甲)和2.9 g檸檬酸鈉(乙)，分別用滅菌注射用水溶解并定容至100 mL，配制成甲液和乙液，將甲液與乙液以57∶43的比例混合均勻配制成檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。STZ供試液：STZ用預(yù)冷4 ℃滅菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液快速溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光冰浴冷藏，10 min內(nèi)注射完成。

1.2.2FCL的制備 無(wú)花果葉采摘后，用清水洗去表面的灰塵和雜質(zhì)，曬干備用。稱取無(wú)花果葉粉末，用5倍量的石油醚超聲振蕩脫脂10 min，重復(fù)脫脂3次，自然陰干備用。稱取脫脂后的無(wú)花果葉粉末100 g，加入40%的乙醇，浸泡過(guò)夜，經(jīng)超聲波提取1 次(超聲功率400 W，時(shí)間30 min，溫度70 ℃)。所得提取液抽濾后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，得濃縮液，經(jīng)冷凍干燥后得灰黑色粉末狀提取物[8]。用適量蒸餾水溶解上述提取物，配制濃度為100 mg/mL的FCL，裝入棕色磨口玻璃瓶中備用。

1.2.3造模方法、分組與給藥 采用一次性腹腔注射STZ 150 mg/kg的方法制備1型糖尿病小鼠模型，以空腹血糖(隔夜禁食不禁水12 h)>11.1 mmol/L為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組、紫果組、日本紫果組、美利亞組、豐產(chǎn)黃組，另設(shè)正常組，共6組，每組10只。不同品系FCL組采用日劑量2 g/kg灌胃，正常組與模型組用蒸餾水灌胃。早晚各灌胃1次，體積均為0.1 mL/10 g，療程6周。

1.2.4測(cè)定GLU，TG及TC 20:00換籠，禁食但不禁水，第2天8:00剪尾取血檢測(cè)空腹GLU，干預(yù)前及干預(yù)6周后各測(cè)1次。給藥6周后，1%戊巴比妥鈉麻醉后摘眼球取血，室溫下放置30 min后，3 500 r/min離心10 min，取血清，置生化分析儀上檢測(cè)小鼠的TG及TC。

1.2.5測(cè)定肝糖原 小鼠脫臼處死，用剪刀將小鼠的腹腔打開(kāi)，充分暴露腹部臟器，將整個(gè)肝臟剪下，分成3～4份(以肝葉來(lái)分)，分裝到凍存管中，投入液氮罐中預(yù)保存，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。檢測(cè)時(shí)，取出肝臟樣本，用生理鹽水漂洗后，濾紙吸干，稱質(zhì)量，按樣本質(zhì)量(mg)∶堿液體積(μL)為1∶3的比例一起加入試管中，沸水浴煮20 min，流水冷卻，制備成糖原水解液，加雙蒸水制備成1%肝糖原檢測(cè)液[質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶100]，按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.6測(cè)定G-6-Pase 從-80 ℃的冰箱中取出肝臟，稱質(zhì)量，按質(zhì)量(g)∶體積(mL)為1∶4的比例加入生理鹽水，在冰水浴中用勻漿器制備成20%的勻漿液，3 000 r/min離心20 min，收集上清液，按試劑盒說(shuō)明書操作。

2 結(jié) 果

2.1不同品系FCL對(duì)糖尿病小鼠GLU，TG及TC的影響 給藥6周后，與模型組比較，4種品系的FCL均能顯著降低糖尿病小鼠的GLU(P<0.01)；與干預(yù)前比較，GLU也均下降(P<0.05)，其中日本紫果較干預(yù)前顯著下降(P<0.01，圖1)。豐產(chǎn)黃、紫果、日本紫果葉提取物均能顯著降低糖尿病小鼠的TG水平(P<0.01)，而美利亞組雖有降低TG水平的趨勢(shì)，但與模型組比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4種品系的FCL對(duì)糖尿病小鼠的TC均沒(méi)有影響(圖2)。

與模型組比較，☆☆：P<0.01；與干預(yù)前血糖比較，#：P<0.05，##：P<0.01.圖1 4種品系的FCL對(duì)血糖的影響Fig 1 Effect of four strains of FCL on blood glucose

2.2不同品系FCL對(duì)糖尿病小鼠肝糖原及G-6-Pase的影響 與模型組比較，日本紫果、美利亞、豐產(chǎn)黃葉提取物均能降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的肝糖原水平，其中豐產(chǎn)黃組與模型組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而紫果、美利亞、豐產(chǎn)黃葉提取物均能降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠肝臟G-6-Pase的水平，其中紫果、美利亞組與模型組比較有顯著性差異(P<0.01，圖2)。

3 討 論

研究表明，無(wú)花果葉有較為確切的降血糖作用，無(wú)花果葉水煎劑對(duì)糖尿病大鼠或糖尿病患者均有顯著的降血糖作用[9-12]。本課題組前期的研究結(jié)果與之一致[13-15]。為了克服水煎劑雜質(zhì)較多、有效成分濃度較低的缺點(diǎn)，本課題組前期采用40%乙醇浸提與超聲波輔助相結(jié)合的方法獲得FCL，通過(guò)GC-MS和UHPLC/DAD聯(lián)合檢測(cè)，結(jié)果顯示，其主要成分為蘆丁、補(bǔ)骨脂素及佛手苷內(nèi)酯，其中蘆丁的含量為1.25%，總黃酮含量為9.47%[13]。

TG：甘油三酯；TC：膽固醇；G-6-Pase：葡萄糖-6-磷酸酶. A：TG；B：TC；C：肝糖原；D：G-6-Pase. 與模型組比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.圖2 四種品系FCL對(duì)各指標(biāo)的影響Fig 2 Effect of four strains of FCL on some indexes in diabetic mice

無(wú)花果在福建地區(qū)資源較為豐富，而紫果、日本紫果、豐產(chǎn)黃、美利亞等為南方地區(qū)培植較多的品種，因此對(duì)4個(gè)品系無(wú)花果葉的降血糖作用進(jìn)行藥效學(xué)研究，對(duì)今后無(wú)花果優(yōu)良品種的選育具有意義。本研究結(jié)果表明，4種品系無(wú)花果葉提取物均能顯著降低1型糖尿病小鼠模型的GLU，其中豐產(chǎn)黃、紫果、日本紫果葉提取物還能顯著降低TG水平。

為初步探討無(wú)花果葉在肝糖異生方面的降糖機(jī)制，筆者考察了4種品系無(wú)花果葉提取物對(duì)1型糖尿病小鼠肝糖原和G-6-Pase水平的影響。結(jié)果表明，日本紫果、美利亞、豐產(chǎn)黃葉提取物均能降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠肝糖原水平，其中豐產(chǎn)黃組與模型組比較有顯著性差異，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16-17]。筆者認(rèn)為，F(xiàn)CL對(duì)糖尿病小鼠肝糖原含量有降低趨勢(shì)，可阻止肝臟中過(guò)多的糖原轉(zhuǎn)變?yōu)檠牵瑥亩鴮?dǎo)致血糖升高，從根本上解決血糖升高問(wèn)題。G-6-Pase是糖代謝中的關(guān)鍵酶之一，是內(nèi)源性葡萄糖輸出最后環(huán)節(jié)一個(gè)重要的限速酶，有直接決定糖異生作用以及機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)的重要作用，已成為研究糖尿病等代謝性疾病的重要靶點(diǎn)[18]。本研究結(jié)果表明，紫果、美利亞、豐產(chǎn)黃葉提取物能降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠肝臟G-6-Pase的水平，其中紫果、美利亞組與模型組比較有顯著性差異。因此推測(cè)，該提取物對(duì)糖尿病小鼠的降血糖作用可能與抑制肝臟的G-6-Pase相關(guān)。

本研究以空腹血糖(隔夜禁食不禁水12 h)>11.1 mmol/L為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。近年來(lái)，通過(guò)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的深入研究，已傾向于認(rèn)定空腹血糖值>11.1 mmol/L或非空腹血糖值>16.7 mmol/L，并伴“三多一少”的癥狀作為實(shí)驗(yàn)性嚙齒類大、小鼠1型糖尿病動(dòng)物模型的成模標(biāo)準(zhǔn)，而以中藥提取物進(jìn)行降糖作用的藥效學(xué)研究中，以11.1 mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)的較多[19-21]。本研究是為了在紫果、美利亞、豐產(chǎn)黃、日本紫果中篩選出降血糖及降TG效果較好的品種，以便進(jìn)行下一步藥效學(xué)和機(jī)制研究，但是只做一個(gè)劑量是本研究的不足之處，在今后對(duì)單一品種的課題試驗(yàn)中，將設(shè)置多個(gè)劑量進(jìn)行研究。

綜上所述，4種品系的FCL均可以降低糖尿病小鼠的血糖水平，但對(duì)肝糖原及G-6-Pase的影響各有不同，這是否與不同品系無(wú)花果葉所含成分不同有關(guān)，還有待今后進(jìn)一步探索。本研究為今后開(kāi)展FCL在肝糖異生方面的機(jī)制研究提供了線索，也為無(wú)花果的優(yōu)良品種選育提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。