李施蒙

（西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所，西藏 拉薩 850000）

目前，重金屬污染已經(jīng)成為亟待解決的世界性難題，環(huán)境中的重金屬如Pd、Cr等可通過(guò)食物鏈的傳遞和富集，最終在人體中累積，破壞正常的生理代謝活動(dòng)，從而危害人體健康［1］。重金屬鎘（Cadmium, Cd）是天然存在于自然環(huán)境中具有極高生物毒性的重金屬元素之一，隨著工業(yè)化、城鎮(zhèn)化的迅速發(fā)展，我國(guó)土壤環(huán)境的Cd含量超標(biāo)狀況日趨嚴(yán)重［2］。重金屬鎘離子進(jìn)入細(xì)胞需要相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或者離子通道，但鎘不是植物必需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，因此植物根部對(duì)鎘離子的吸收主要依靠Zn、Fe、Mn等與其化學(xué)結(jié)構(gòu)相似必需元素的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或通道［3］。對(duì)于植物的生長(zhǎng)而言，Zn是不可或缺的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，金屬耐受蛋白MTP1（Metal tolerance protein 1）作為一種跨膜蛋白在植物鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起著重要作用。在十字花科植物擬南芥［4］中最先報(bào)道的陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CDF）家族成員MTP1，主要參與鋅離子向細(xì)胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)［5］。

研究發(fā)現(xiàn)，CDF家族廣泛存在于細(xì)菌、酵母、擬南芥等原核和真核生物中，主要定位于膜體如細(xì)菌的細(xì)胞膜、植物和酵母的液泡膜以及哺乳動(dòng)物的高爾基體等膜上［6-7］，具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（Transmembrane domain，TMD）［8］。植物中，擬南芥的AtMTP1基因是研究最透徹的CDF家族蛋白［9］，MTP1蛋白能將鋅離子從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到液泡。隨后蘿卜［10］和水稻［11］中的MTP1基因也相繼被克隆，煙草過(guò)表達(dá)NtMTP1基因后植株對(duì)鋅脅迫的耐受性顯著增強(qiáng)［12］。

目前蕓薹屬中甘藍(lán)型油菜耐鎘脅迫的研究［13-14］已有報(bào)道，但對(duì)MTP1基因的研究卻較少。本研究根據(jù)蕓薹屬AC基因組作物的親緣物種擬南芥的MTP1基因序列作為基序，在白菜（Brassica rapa）［15］、甘藍(lán)（B.oleracea）［16］、甘藍(lán)型油菜（B.napus）［17］3個(gè)物種的全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選和鑒定蕓薹屬AC基因組MTP1基因，并從系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、蛋白理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位和基因組織表達(dá)特異性等方面進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究蕓薹屬作物中MTP1基因參與鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制奠定基礎(chǔ)，促進(jìn)低積累重金屬蕓薹屬作物的種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.arabidopsis.org/）中檢索并下載擬南芥MTP1基因的CDS序列。以擬南芥MTP1基因的CDS序列為基序利用蕓薹屬數(shù)據(jù)庫(kù)（http://brassicadb.org/brad/），分別在白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜基因組CDS數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastn搜索（值為1e-100），同時(shí)利用在線軟件SMART對(duì)下載的擬南芥MTP1蛋白序列和Blast檢索得到的白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜MTP1候選基因的蛋白序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)合CDF蛋白家族MTP1蛋白序列的結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)進(jìn)一步鑒定蕓薹屬AC基因組中的MTP1候選基因。

1.2 理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位分析

利用在線分析軟件ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）［18］分析蕓薹屬 AC基因組中的MTP1基因和擬南芥MTP1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，包括分子量（Molecular Weight）、理論等電點(diǎn)（Theoretical pI）、不穩(wěn)定系數(shù)（Instability index）和親疏水性（Grand average of hydropathicity, GRAVY）等。利用軟件Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）對(duì)上述MTP1基因編碼的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用軟件TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域分析。利用在線分析軟件Sopma Secondary Structure Prediction Method（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=npsa_sopma.html）對(duì)MTP1基因的蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。利用 NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對(duì)蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用軟件MEGA5.2的鄰近法（neighbor-joining,NJ）［19］，對(duì)蕓薹屬AC基因組中MTP1蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，采用p-distance模型，并設(shè)置Bootstrap值為1 000進(jìn)行校正，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 甘藍(lán)型油菜BnMTP1不同組織部位的表達(dá)模式分析

使用甘藍(lán)型油菜栽培種中雙11的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)［20］，提取BnMTP1基因在根、莖、葉、蕾、花和種子等組織部位的表達(dá)量FPKM值，比較分析其表達(dá)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕓薹屬AC基因組中MTP1基因家族的鑒定

本研究利用擬南芥AtMTP1基因的CDS序列，通過(guò)蕓薹屬數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜基因組CDS序列進(jìn)行Blastn同源比對(duì)。由于CDF家族中MTP1蛋白含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，對(duì)獲得的同源序列再使用SMART軟件進(jìn)一步鑒定。結(jié)果（表1）表明，在白菜基因組中獲得1條序列，位于A03染色體上，命名為BrMTP1A03（Bra000432）；在甘藍(lán)基因組中獲得3條序列，均位于C04染色體上，分別命名為BolMTP1-1（Bol004901）、BolMTP1-2（Bol014388） 和BolMTP1-3（Bol021804）。在甘藍(lán)型油菜A亞基因組中獲得3條序列，分別位于A03、A04和A05染色體上，命名為BnMTP1A03（BnaA03g21530D）、BnMTP1A04（BnaA04g26760D）和BnMTP1A05（BnaA05g01080D）；在C亞基因組中獲得1條序列，位于C04染色體上，命名為BnMTP1C04（BnaC04g00620D）。這些基因編碼序列（coding sequence, CDS）長(zhǎng)度為 990～1 437 bp，除BnMTP1A04含有4個(gè)外顯子外，蕓薹屬AC基因組中的其他MTP1基因均只含有1個(gè)外顯子。

表1 蕓薹屬AC基因組MTP1基因的相關(guān)信息

2.2 MTP1蛋白的理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位

利用軟件Plant-mPLoc對(duì)蕓薹屬AC基因組中鑒定的MTP1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白均定位于液泡，結(jié)合擬南芥AtMTP1蛋白定位于液泡膜，故推測(cè)這些MTP1蛋白也屬于液泡跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，助其行使金屬鋅離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

使用ProtParam在線分析工具對(duì)MTP1蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果（表2）表明，蕓薹屬AC基因組中的MTP1蛋白均包含20種常見氨基酸，均不含有硒代半胱氨酸和吡咯賴氨酸。蛋白序列長(zhǎng)度最短的為329 aa（BnMTP1C04和BolMTP1-1），最長(zhǎng)的為478 aa（BnMTP1A04）；分子量最小的為36.59 749 ku（BolMTP1-1），最大為53.07 049 ku（BnMTP1A04）；等電點(diǎn)（pI）最低為5.69（BnMTP1A05和BolMTP1-2），最高為7.03（BnMTP1A04）；穩(wěn)定性系數(shù)最小為32.93（BolMTP1-1），最大為42.23（BnMTP1A04），除BnMTP1A04外均為穩(wěn)定蛋白（＜40）；脂肪族氨基酸系數(shù)最小為106.46（BnMTP1A04），最大為121.73（BnMTP1C04和BolMTP1-1）；帶負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)（Asp/Glu）和帶正電荷氨基酸殘基數(shù)（Arg/Lys）最小值分別為37、22（BnMTP1C04和BolMTP1-1），最大值為47、45（BnMTP1C04和BolMTP1-1）。

親疏水性分析發(fā)現(xiàn)肽鏈總體均表現(xiàn)為疏水性（正值），疏水性系數(shù)最小為0.091（BnMTP1A04），最大為0.359（BolMTP1-1），可見這些MTP1蛋白均表現(xiàn)為疏水性，不是水溶性蛋白，這與其屬于膜蛋白的特性相吻合。

表2 蕓薹屬AC基因組MTP1蛋白的理化性質(zhì)

2.3 蕓薹屬AC基因組中MTP1基因進(jìn)化分析及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是連接一級(jí)和高級(jí)結(jié)構(gòu)的重要紐帶和橋梁，它為高級(jí)結(jié)構(gòu)分析奠定了基礎(chǔ)［21］。使用在線分析軟件SOPMA對(duì)MTP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MTP1蛋白主要由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角等4種結(jié)構(gòu)組成（表3），α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)元件，占比接近50%，其次是無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈，β-轉(zhuǎn)角最少。CDF家族中MTP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白擁有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋組成，預(yù)測(cè)結(jié)果符合MTP1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基本結(jié)構(gòu)特征。

表3 MTP1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 MTP1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點(diǎn)分析

利用HMHMM Server軟件對(duì)MTP1蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果（表4）表明，這些蛋白的典型結(jié)構(gòu)特征具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（TM1～TM6）。擬南芥的AtMTP1蛋白第一跨膜區(qū)在前60 aa區(qū)間內(nèi)，蕓薹屬AC基因組的MTP1蛋白中，BnMTP1C04、BolMTP1-1和BolMTP1-2的第一跨膜區(qū)均在前60 aa區(qū)間內(nèi)，除了BnMTP1A04外，所有MTP1蛋白的第一跨膜區(qū)均是從前60 aa區(qū)間開始，BnMTP1A04從155號(hào)氨基酸殘基開始。MTP1蛋白的6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域中，前4個(gè)跨膜域連續(xù)串聯(lián)分布，后2個(gè)跨膜域連續(xù)串聯(lián)分布，在第四和第五跨膜區(qū)之間有一個(gè)長(zhǎng)環(huán)。

蛋白質(zhì)磷酸化是生物體內(nèi)普遍存在的一種重要活性調(diào)節(jié)機(jī)制。使用NetPhos 3.1軟件對(duì)蕓薹屬AC基因組中MTP1蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果（表5）發(fā)現(xiàn)白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜的MTP1均具有多種不同的磷酸化位點(diǎn)，其中，絲氨酸磷酸化位點(diǎn)（Ser）最多為25個(gè)（BnMTP1A04），最少為11個(gè)（BnMTP1C04、BolMTP1-1）；蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)（Thr）最多為14個(gè)（BnMTP1A04、BnMTP1A05），最少為7個(gè)（BolMTP1-2）；酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（Tyr）只在甘藍(lán)BolMTP1-2中具有1個(gè)，其他MTP1蛋白均不具有酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。說(shuō)明MTP1蛋白的磷酸化主要以絲氨酸和蘇氨酸磷酸化為主。

表4 MTP1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

表5 MTP1蛋白的磷酸化位點(diǎn)分析

2.5 MTP1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用MEGA5.2軟件的NJ法構(gòu)建蕓薹屬AC基因組MTP1的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖1）表明，甘藍(lán)型油菜BnMTP1A03與白菜BrMTP1A03、BnMTP1C04與 甘 藍(lán)BolMTP1-1、BnMTP1A04與BolMTP1-3分別聚類在同一個(gè)分支上，說(shuō)明其遺傳距離最近；BnMTP1C04、BolMTP1-1又與BnMTP1A05聚類在一個(gè)分支上，說(shuō)明其遺傳距離較近；而AtMTP1和BolMTP1-2分別在單獨(dú)一個(gè)分支上。根據(jù)氨基酸構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，也反映其同源進(jìn)化的親緣關(guān)系，甘藍(lán)型油菜A亞基因組的BnMTP1A03與白菜A基因組的BrMTP1A03親緣關(guān)系最近；甘藍(lán)型油菜C亞基因組的BnMTP1C04與甘藍(lán)C基因組的BolMTP1-1親緣關(guān)系最近，同時(shí)與甘藍(lán)型油菜A亞基因組的BnMTP1A05親緣關(guān)系較近；而甘藍(lán)型油菜A亞基因組的BnMTP1A04與甘藍(lán)C基因組的BolMTP1-3親緣關(guān)系最近，說(shuō)明甘藍(lán)型油菜在繼承白菜和甘藍(lán)基因組的同時(shí)，不同亞基因組之間發(fā)生融合重組事件。

圖1 蕓薹屬AC基因組MTP1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.6 甘藍(lán)型油菜BnMTP1基因不同組織部位表達(dá)模式分析

為了進(jìn)一步從基因表達(dá)水平上研究MTP1基因的表達(dá)模式，利用已發(fā)表的甘藍(lán)型油菜栽培種中雙11的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分別提取根、莖桿、幼葉、成熟葉、花蕾和花后10 d、21 d、30 d種子中BnMTP1基因表達(dá)量的FPKM值進(jìn)行比較分析。如圖2所示，在甘藍(lán)型油菜中MTP1基因在不同組織部位中均有表達(dá)，BnMTP1A03和BnMTP1A05在花蕾中的表達(dá)量最高，而BnMTP1A04和BnMTP1C04在花后10 d種子中的表達(dá)量最高；BnMTP1A04和BnMTP1A05在根中的表達(dá)量最低，BnMTP1A03和BnMTP1C04在花后30 d種子中的表達(dá)量最低。甘藍(lán)型油菜中4個(gè)BnMTP1同源基因的表達(dá)水平也存在明顯差異，BnMTP1A04表達(dá)水平相對(duì)最高，明顯高于其他3個(gè)基因，BnMTP1A03的表達(dá)水平相對(duì)最低。

圖2 油菜BnMTP1基因表達(dá)模式分析

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)有關(guān)植物重金屬跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體的研究取得重要進(jìn)展［22］，如HMA、ABCA、CAX等轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子跨膜運(yùn)載蛋白的基因已有報(bào)道，根據(jù)其位于不同組織細(xì)胞和不同細(xì)胞器，分為金屬離子輸入蛋白（Metal uptake protein）和金屬離子輸出蛋白（Metal efflux protein），分別介導(dǎo)金屬離子進(jìn)入和泵出胞質(zhì)。而且這些基因的過(guò)量表達(dá)對(duì)金屬在細(xì)胞中的運(yùn)輸、分布和富集及提高植物的抗性方面發(fā)揮了重要作用［23］。目前研究較為深入的主要有CDF家族［24］、ZIP（Zinc-Iron Regulated Transproter Proteins）家 族、Nramp（Natural Resistance-Associated Macrophage Proteins）家族、重金屬ATP酶（HMAs）、ABC（ATP-Binding Cassette）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及金屬陽(yáng)離子/H+反向運(yùn)輸器等［25-26］。本研究旨在從生物信息學(xué)層面解析蕓薹屬AC基因組中CDF家族成員MTP1基因和蛋白的特性，為后續(xù)研究其分子功能奠定基礎(chǔ)。

MTP1蛋白在植物中普遍存在，且仍不斷有新的CDF家族蛋白被鑒定［27］，對(duì)其研究也不斷深入，但MTP1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能機(jī)制還有較多未知，有待進(jìn)一步研究。結(jié)構(gòu)上MTP1蛋白的三維結(jié)構(gòu)分析仍然處于使用模型分析軟件進(jìn)行推測(cè)階段，楊樹中負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)鋅離子的PtMTP蛋白在體外形成一個(gè)寡聚同系物［28］，其可被二硫蘇糖醇破壞，說(shuō)明二硫鍵可能在其形成過(guò)程中起到一定作用，MTP蛋白很可能是以同型二聚體的形式存在并發(fā)揮功能。本研究通過(guò)比對(duì)蕓薹屬白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜等物種的基因組，在AC基因組中共鑒定到8個(gè)MTP1基因，并對(duì)其蛋白質(zhì)一級(jí)、二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些MTP1蛋白含有20種常見氨基酸，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈為主，跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)均含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，與已有文獻(xiàn)報(bào)道一致，屬于膜蛋白。功能上MTP1蛋白不僅有轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子的作用，在抵抗重金屬脅迫過(guò)程也扮演重要角色，用于解除過(guò)度積累的金屬對(duì)生物的毒性，還可能用于促進(jìn)離子傳遞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［29］。對(duì)蕓薹屬AC基因組MTP1蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)均為穩(wěn)定性蛋白，表現(xiàn)為疏水性，這與其屬于膜蛋白的特性相吻合，利于執(zhí)行轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子的功能。

擬南芥AtMTP1 基因［30］和苜蓿MtMTP1［31］基因主要在幼嫩的葉片中表達(dá)，水稻OsMTP1基因［33］主要在成熟老葉和莖中表達(dá)，煙草NtMTP1基因［12］則主要在花和葉片中表達(dá)，根、莖和種子中的表達(dá)量較低。本研究中甘藍(lán)型油菜BnMTP1基因在花蕾和花后10 d種子中的表達(dá)量較高，根和莖的表達(dá)量最低，其次是葉片。甘藍(lán)型油菜BnMTP1基因在不同的組織部位中均有表達(dá)，地上部分的表達(dá)高于根部的表達(dá)，說(shuō)明地上部分的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)更活躍。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究蕓薹屬植物MTP1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制奠定基礎(chǔ)，目前甘藍(lán)型油菜BnMTP1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究較少，若通過(guò)基因工程等分子技術(shù)實(shí)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜對(duì)重金屬鎘的富集，將推進(jìn)新用途油菜的開發(fā)利用，為重金屬污染的生態(tài)修復(fù)提供幫助。