張敬梅， 顧以韌， 李江淩， 陳曉暉， 曾凱， 呂學(xué)斌*， 高榮

(1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物疫病防控和食品安全 四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610065； 2.四川省畜牧科學(xué)研究院，成都610066)

中國(guó)是世界上最大的豬肉生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；c集約化程度的不斷提高，各種細(xì)菌和病毒傳染性疾病經(jīng)常發(fā)生和流行，不僅嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和經(jīng)濟(jì)效益，也威脅人民公共衛(wèi)生和食品安全。豬Susscrofadomesticus的病原微生物種類多、變異快，導(dǎo)致疫苗和新藥研發(fā)成本高，防治效果受限。因此，培育抗病新豬種是目前解決豬病危害、提高養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)效益和保障公共衛(wèi)生與食品安全經(jīng)濟(jì)高效的新途徑。

Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)是1997年發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)天然免疫和獲得性免疫的病原模式識(shí)別受體家族，通過啟動(dòng)天然免疫反應(yīng)和激發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)，在宿主防御微生物病原體感染過程中發(fā)揮作用(Shaoetal.，2016)。TLRs屬于病原相關(guān)分子模式(pattern-associated molecular patterns，PAMPs)的識(shí)別受體，通過與病原的固有分子結(jié)合、激發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，誘導(dǎo)趨化因子和細(xì)胞因子的分泌，發(fā)揮先天免疫作用，并激活一系列適應(yīng)性免疫反應(yīng)(Kawai & Akira，2010；Zaidietal.，2016)。研究表明，TLRs是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機(jī)體抗感染免疫中起著非常重要的作用(何小兵等，2011；Thakuretal.，2015)。TLRs能識(shí)別不同的PAMPs，包括脂多糖、雙鏈RNA病毒、脂蛋白、細(xì)菌CpG DNA及肽聚糖等(Leifer & Medvedev，2016；Luetal.，2018)。根據(jù)TLRs在細(xì)胞內(nèi)的定位分為2個(gè)亞家族：細(xì)胞膜表面的TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR11和細(xì)胞內(nèi)膜的TLR3、TLR7、TLR8、TLR9(Yu & Feng，2018)。不同的TLRs識(shí)別不同的配體：細(xì)胞膜表面的TLRs主要識(shí)別病原的膜成分；TLR2與TLR1或TLR6形成異源二聚體，識(shí)別革蘭氏陽性菌的肽聚糖和磷壁酸；TLR4識(shí)別革蘭氏陰性菌表面的脂多糖；TLR5識(shí)別細(xì)菌的鞭毛蛋白；TLR11識(shí)別一些尿道細(xì)菌；細(xì)胞內(nèi)膜的TLR3、TLR7、TLR8、TLR9主要識(shí)別病毒核酸成分(Hajishengallis & Lambris，2016)。養(yǎng)豬業(yè)常見的病毒性疾病包括豬瘟、口蹄疫、藍(lán)耳病等，這些病毒屬于單鏈RNA病毒。

抗菌肽是生物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，是抵御外界有害微生物或病毒入侵的重要屏障，也是生物體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分(Andreu & Rivas，2015；Bechinger & Gorr，2017)，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要有防御素和Cathelicidin兩大抗菌肽家族(宴家友等，2013)。有關(guān)豬源抗菌肽的研究較全面：β-防御素1(poricine-β-defensin 1，pBD-1)是廣泛分布于呼吸道、消化道、胸腺、脾臟等組織內(nèi)的一類活性多肽(江學(xué)斌等，2016)，通過作用于病原體的細(xì)胞膜發(fā)揮抗菌作用，不會(huì)誘發(fā)細(xì)菌耐藥性，具有廣譜抗細(xì)菌、抗真菌及抗病毒活性，參與組成機(jī)體的先天性免疫系統(tǒng)，在抗感染中發(fā)揮重要作用(Aonoetal.，2006；Pruthvirajetal.，2016)；PR-39是Cathecilidin家族中富含脯氨酸和精氨酸的小分子肽，具有較強(qiáng)的抗菌、抗病毒活性，對(duì)革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌具有很好抑菌效果，在動(dòng)物機(jī)體先天免疫和抗感染免疫方面也發(fā)揮重要作用(Chenetal.，2015；盧順等，2015)。

成華豬是四川省著名的地方優(yōu)良豬種，是四川推廣數(shù)量較多、覆蓋地域較廣的地方豬種，具有早熟易肥、肌纖維較短等優(yōu)點(diǎn)，但也有生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、養(yǎng)殖期耗料高等缺點(diǎn)。烏金豬具有耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、肉質(zhì)優(yōu)良、抗逆性強(qiáng)及肌內(nèi)脂肪豐富等優(yōu)良性狀，但繁殖力低、生長(zhǎng)慢、瘦肉率低。青峪豬作為四川省通江縣的地方豬種之一，具有耐粗性好、繁殖力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)、肉味香濃、口感細(xì)膩等優(yōu)點(diǎn)。約克夏豬是我國(guó)引進(jìn)的國(guó)外豬種，具有繁殖力高、生長(zhǎng)快、瘦肉率高等優(yōu)點(diǎn)，但抗病力和耐逆性較我國(guó)地方豬種弱(吳圣龍等，2008)。

雖有一些文獻(xiàn)報(bào)道了不同豬種TLRs、pBD-1和PR-39的表達(dá)水平(安沙等，2011；高彥華，2014；Holanietal.，2016)，但目前尚無成華豬、烏金豬和青峪豬先天免疫分子特征的研究報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TLRs(TLR1、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9)、pBD-1和PR-39 mRNA在成華豬、烏金豬、青峪豬和約克夏豬的5種免疫器官和組織(胸腺、脾臟為系統(tǒng)免疫器官，扁桃體、腸系膜淋巴結(jié)為消化道局部免疫組織，肺門淋巴結(jié)為呼吸道局部免疫組織)中的表達(dá)差異，旨在揭示這些地方豬種之間TLRs和抗菌肽基因表達(dá)水平與約克夏豬的差異及特點(diǎn)，有助于從先天免疫分子層面深入闡明地方豬種抗病力較強(qiáng)的分子基礎(chǔ)，為今后利用地方豬種雜交培育抗病品系和篩選抗病分子標(biāo)記提供科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與采樣

實(shí)驗(yàn)用成華豬、烏金豬、青峪豬和約克夏豬來自四川省畜牧科學(xué)研究院簡(jiǎn)陽種豬場(chǎng)，同組實(shí)驗(yàn)豬均為同品種不同窩的母豬(非半同胞，父母不同)，各組實(shí)驗(yàn)豬采用相同營(yíng)養(yǎng)水平和飼喂方式，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同，8月齡時(shí)地方豬種體質(zhì)量75～90 kg，約克夏豬125～135 kg。每組隨機(jī)選取5頭健康個(gè)體屠宰，取胸腺、脾臟、扁桃體、腸系膜淋巴結(jié)和肺門淋巴結(jié)樣品，無菌生理鹽水漂洗，迅速剪切后于液氮中速凍，-80 ℃保存。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

RNA提取試劑用Trizol(TaKaRa)，組織樣品100 mg，剪碎，加1 mL 1×磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(成都奧克生物公司)，使用TL2010S中通量組織研磨破碎儀(北京鼎昊源科技有限公司)研磨組織，12 000 r·min-14 ℃離心4 min；吸取上清0.2 mL，加入0.8 mL Trizol，劇烈震蕩，靜置10 min；加0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置10 min，12 000 r·min-14 ℃離心15 min；吸取上清液0.4 mL轉(zhuǎn)入新的EP管中，加入-20 ℃預(yù)冷15 min的異丙醇0.4 mL，混勻，室溫靜置10 min，12 000 r·min-14 ℃離心15 min；棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌，7 500 r·min-14 ℃離心6 min，棄上清，干燥后加入30 μL無酶水溶解。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，核酸分析儀NanoDrop2000(Thermo，美國(guó))檢測(cè)總RNA的濃度和純度。第一鏈cDNA的合成參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech，北京)說明書進(jìn)行。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中報(bào)道的基因序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，其中，肽基脯氨酰異構(gòu)酶A(peptidylprolyl isomer-ase A，PPIA)為內(nèi)參基因，引物序列及退火溫度見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time quantitative PCR

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

以PPIA為內(nèi)參基因，在Bio-Rad IQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。擴(kuò)增體系如下：3 μL模板cDNA，上、下游引物各0.5 μL，7.5 μL 2×SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix，加水補(bǔ)至15 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，按表1中所列的退火溫度退火/延伸30 s，讀板收集熒光，共40個(gè)循環(huán)；最后從65 ℃開始以每秒0.5 ℃遞增至95 ℃進(jìn)行熔解曲線特異性分析。每個(gè)樣品重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)置無模板對(duì)照。

1.5 基因片段擴(kuò)增效率的比較

以PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋(10-1～10-7)，對(duì)所有引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，輸入濃度梯度的數(shù)值，由Bio-Rad IQ5根據(jù)反應(yīng)所得數(shù)據(jù)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到相應(yīng)的擴(kuò)增效率(E)和可信度(R2)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果以PPIA為內(nèi)參基因，以約克夏豬的組織作為對(duì)照組，用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。數(shù)據(jù)使用Grapad Prism 6.01，各組織間的基因表達(dá)采用Two-Way ANOVA分析，并用Tukey法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的純度與完整性

RNA純度檢測(cè)結(jié)果顯示，樣品的A260/280為 1.9～2.1，A260/230為2.0～2.5，說明RNA提取的質(zhì)量較高。提取的各組織總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，28S、18S和5.8S條帶均清晰可見，說明提取的RNA完整性較好，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物特異性及擴(kuò)增效率

從實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物熔解曲線可以看出，各基因的熔解曲線均為單峰，無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物形成。標(biāo)準(zhǔn)曲線分析結(jié)果表明，所有引物對(duì)經(jīng)優(yōu)化退火溫度后基因擴(kuò)增效率均接近100%，可信度高(R2>0.98)，表明該體系可用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量。

2.3 TLRs mRNA的表達(dá)比較

由圖1可知，成華豬胸腺中TLR7，脾臟中TLR4、TLR7，腸系膜淋巴結(jié)中TLR4、TLR9，肺門淋巴結(jié)中TLR1、TLR4、TLR7、TLR9 mRNA表達(dá)水平顯著高于其他豬種(P<0.05)；烏金豬胸腺中TLR1、TLR9，扁桃體中TLR1、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9和腸系膜淋巴結(jié)中TLR7 mRNA表達(dá)水平顯著高于其他豬種(P<0.05)。

2.4 pBD-1與PR-39 mRNA的表達(dá)比較

由圖2可知，成華豬胸腺中PR-39 mRNA表達(dá)水平顯著高于其他豬種(P<0.05)；烏金豬扁桃體中pBD-1 mRNA表達(dá)水平顯著高于其他豬種(P<0.05)；青峪豬扁桃體、腸系膜淋巴結(jié)中PR-39 mRNA表達(dá)水平顯著高于其他豬種(P<0.05)；約克夏豬脾臟、肺門淋巴結(jié)中pBD-1和PR-39 mRNA表達(dá)水平顯著高于其他豬種(P<0.05)。

3 討論

先天性免疫系統(tǒng)是動(dòng)物抵御病原入侵的第一道防線，PAMPs是先天性免疫的重要組成部分，在機(jī)體抵抗外界微生物入侵中起著重要的防御作用。TLR1、TLR2、TLR7、TLR9介導(dǎo)MyD88依賴性信號(hào)途徑；TLR4既可介導(dǎo)MyD88依賴途徑，也可介導(dǎo)TRIF依賴途徑。TLR7識(shí)別人工合成核酸的類似物以及來自單鏈病毒的ssRNA和siRNA，當(dāng)宿主受到病原菌侵襲時(shí)，通過激活MyD88依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生Ⅰ型干擾素和炎癥細(xì)胞因子發(fā)揮抗病毒效應(yīng)(Duetal.，2016；Petesetal.，2017)；抗菌肽作為動(dòng)物先天性免疫系統(tǒng)的重要防御物質(zhì)，具有廣譜抗菌活性和抗腫瘤、抗病毒等生物活性。本文選擇了成華豬、烏金豬、青峪豬和約克夏豬的5種免疫器官和組織(胸腺、脾臟、扁桃體、腸系膜淋巴結(jié)、肺門淋巴結(jié))進(jìn)行了TLRs和抗菌肽基因mRNA的表達(dá)研究。

動(dòng)物胸腺是免疫系統(tǒng)的中樞器官，在機(jī)體免疫，特別是在細(xì)胞免疫的演化、成熟和功能調(diào)節(jié)中起決定性作用，是參與免疫系統(tǒng)調(diào)控的主要內(nèi)分泌腺；在T細(xì)胞的分化、發(fā)育、選擇和成熟過程中起關(guān)鍵作用，可促進(jìn)T細(xì)胞發(fā)育成熟，表達(dá)不同的分化抗原，經(jīng)胸腺選擇后獲得主要組織相容性復(fù)合體限制性(Sinkora & Butler，2009)，維持機(jī)體正常的免疫平衡(龔非力，2000)。脾臟作為外周免疫器官，是機(jī)體最大的免疫器官，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心(Cesta，2006)。

圖1 實(shí)驗(yàn)豬免疫器官組織中TLRs mRNA的表達(dá)水平比較
Fig. 1 Comparison of the mRNA expression levels of TLRs in the immune organs and tissues of experimental pigs

不同字母表示組間數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 下圖同

Different letters indicate there is a significant difference between groups (P<0.05)； the same below

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成華豬胸腺TLR7、PR-39 mRNA，脾臟TLR4、TLR7 mRNA表達(dá)水平較高，說明成華豬免疫器官的先天免疫水平明顯強(qiáng)于其他豬種；烏金豬胸腺中TLR1、TLR9 mRNA表達(dá)水平較高，表明烏金豬胸腺在先天免疫和抗感染免疫方面發(fā)揮重要作用。

扁桃體位于消化道和呼吸道入口的交會(huì)處，是機(jī)體第一道防線的重要組成部分，在抵御外界病原微生物的入侵中發(fā)揮著重要的作用。豬pBD-1 mRNA在舌和口腔黏膜高轉(zhuǎn)錄水平有利于黏膜和系統(tǒng)性防御(Qietal.，2009；Jiaoetal.，2017)。腸系膜淋巴結(jié)作為腸道相關(guān)淋巴組織中的一個(gè)重要組分，是機(jī)體免疫系統(tǒng)與外來抗原以及微生物較早接觸的免疫器官，同時(shí)也是較早發(fā)生免疫反應(yīng)的器官(Teixeiraetal.，2013；張秀林等，2017)。PR-39 mRNA在腸系膜淋巴結(jié)中的表達(dá)差異可能與腸道內(nèi)多種病原微生物的聚集有關(guān)。pBD-1不僅在模擬生理?xiàng)l件下抗菌效果明顯，而且與PR-39等Cathelicidin家族抗菌肽協(xié)同抗菌和抗病毒的作用非常顯著，在機(jī)體先天性免疫和獲得性免疫中發(fā)揮一定的免疫調(diào)節(jié)作用(Yangetal.，2001；Sangetal.，2006)。有報(bào)道表明，咽鼓管扁桃體表達(dá)TLRs(Lesmeisteretal.，2006)，在天然免疫中發(fā)揮著重要作用(Manssonetal.，2006)，同時(shí)在機(jī)體抵抗外界病原微生物的應(yīng)答中也發(fā)揮著重要作用。烏金豬扁桃體中TLR1、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9、pBD-1和腸系膜淋巴結(jié)中TLR7 mRNA表達(dá)水平均高于其他豬種，表明其消化道局部黏膜先天性免疫具有優(yōu)勢(shì)。TLRs可識(shí)別病原微生物模式分子，參與誘導(dǎo)調(diào)控哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞分泌抗菌肽殺死入侵機(jī)體的有害微生物(全佳慧等，2016)。成華豬腸系膜淋巴結(jié)中TLR4、TLR9 mRNA有較高的表達(dá)水平，說明成華豬腸系膜淋巴結(jié)通過PAMPs識(shí)別特定的病原微生物發(fā)揮特定的先天性免疫水平較高。青峪豬扁桃體和腸系膜淋巴結(jié)中PR-39 mRNA有較高的表達(dá)水平，表明其在抗菌及抗病毒等方面具有優(yōu)勢(shì)。成華豬肺門淋巴結(jié)中TLR1、TLR4、TLR7、TLR9 mRNA有較高的表達(dá)水平，表明在成華豬肺門淋巴結(jié)中通過抗原遞呈，借助TLRs識(shí)別PAMPs，激活宿主的先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)，抵抗病原微生物的感染(Ignacioetal.，2005；Holtetal.，2008；Kuzemtsevaetal.，2014)。

圖2 實(shí)驗(yàn)豬不同免疫器官組織中pBD-1和PR-39 mRNA的表達(dá)水平比較Fig. 2 Comparison of the expression levels of pBD-1 and PR-39 mRNA in the immune organs and tissues of experimental pigs

呼吸道和消化道是各種致病微生物進(jìn)入機(jī)體的主要通道，很多病原微生物由此侵害宿主，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病(Kirstil?etal.，1996)。上述結(jié)果表明，地方豬種相關(guān)局部免疫器官組織中TLRs高表達(dá)有助于機(jī)體發(fā)揮較強(qiáng)的先天性免疫反應(yīng)，抵抗入侵的病原微生物，這為不同品種豬對(duì)于同一病原表現(xiàn)出不同抵抗力或敏感性提供了理論依據(jù)。

綜上所述，成華豬TLRs基因在系統(tǒng)免疫、消化道、呼吸道局部免疫組織以及PR-39基因在胸腺中高表達(dá)，表明成華豬在先天性免疫應(yīng)答及抗病能力方面具有優(yōu)勢(shì)。烏金豬TLRs基因在系統(tǒng)免疫器官、消化道局部免疫組織和pBD-1基因在扁桃體中高表達(dá)，表明其消化道有較強(qiáng)的先天免疫抗感染機(jī)能。本實(shí)驗(yàn)揭示了地方豬種TLRs和抗菌肽基因在免疫器官組織中的表達(dá)水平及特點(diǎn)，可為利用地方豬種雜交選育抗病力強(qiáng)的新品種提供有益的線索和依據(jù)。