崔凱， 岳碧松

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610065)

微衛(wèi)星每個(gè)單元長(zhǎng)1～6 bp，廣泛分布于真核生物的基因組中，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)(Beckman & Weber，1992)。研究表明，可能是DNA復(fù)制過(guò)程中的“滑鏈(strand slippage)”現(xiàn)象造成微衛(wèi)星DNA多態(tài)性信息容量較高(Levinson & Gutman，1987)。由于多態(tài)性信息豐富、易于檢測(cè)、數(shù)量多、在基因組內(nèi)分布均勻等優(yōu)點(diǎn)，微衛(wèi)星被作為優(yōu)良的遺傳標(biāo)記得到了廣泛的應(yīng)用(Guptaetal.，1996；Pérezetal.，2001；Maetal.，2004)。

綠尾虹雉Lophophoruslhuysii隸屬于雞形目Galliformes雉科Phasianidae，中國(guó)特有種，國(guó)家Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)瀕危物種紅色名錄將其列為易危(VU)物種(BirdLife International，2016)。綠尾虹雉主要分布于四川、云南西北部、西藏東南部、甘肅東南部和青海南部(鄭光美，2015)，常棲息于海拔3 000～4 500 m的高山草甸、灌叢和裸巖地帶，缺少食物的冬季會(huì)垂直遷徙到海拔2 000 m左右的地區(qū)活動(dòng)(何芬奇，盧汰春，1985；盧汰春等，1986)。由于人類活動(dòng)和自然災(zāi)害等因素，綠尾虹雉的種群數(shù)量持續(xù)下降(劉夢(mèng)瑤等，2013)。本研究從基因組水平對(duì)綠尾虹雉的微衛(wèi)星特性及相關(guān)功能進(jìn)行分析，可對(duì)該物種的群體遺傳多樣性和親緣關(guān)系的研究提供數(shù)據(jù)支持，為該物種的保護(hù)提供有用信息。

1 研究方法

1.1 綠尾虹雉全基因組序列

綠尾虹雉的全基因組序列由本實(shí)驗(yàn)室測(cè)序組裝，基因組全長(zhǎng)1.01 Gb，Scaffold N50為6.9 Mb。相關(guān)研究項(xiàng)目信息及測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI(Bioproject ID：PRJNA321629)。基因組的相關(guān)基因結(jié)構(gòu)注釋也由本實(shí)驗(yàn)室分析所得。

1.2 數(shù)據(jù)分析

1.2.1微衛(wèi)星搜索統(tǒng)計(jì)和定位微衛(wèi)星的搜索和統(tǒng)計(jì)利用本實(shí)驗(yàn)室自主開(kāi)發(fā)的Krait(Duetal.，2017)完成，該軟件可從Github(https：//github.com/lmdu/krait/releases)下載。對(duì)綠尾虹雉全基因組Scaffolds的FASTA序列上的微衛(wèi)星序列進(jìn)行搜索和統(tǒng)計(jì)，得到相關(guān)的類型和位置信息。本研究微衛(wèi)星的搜索標(biāo)準(zhǔn)為：?jiǎn)螇A基重復(fù)12次以上，二堿基重復(fù)7次以上，三堿基重復(fù)5次以上，四到六堿基重復(fù)次數(shù)均為4次以上。進(jìn)一步利用自編腳本與基因組注釋GFF文件和得到的微衛(wèi)星注釋文件進(jìn)行比較查找，定位外顯子中所含的全部微衛(wèi)星序列，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到所含微衛(wèi)星外顯子的基因FASTA序列。

1.2.2微衛(wèi)星所在外顯子的基因序列注釋分析注釋分析主要利用Gene Ontology(GO)和KEGG通路注釋。GO注釋要先將編碼基因的蛋白質(zhì)序列與NR庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)(參數(shù)：E-value<1E-5)，隨后的結(jié)果導(dǎo)入Blast2GO(Conesaetal.，2005)進(jìn)行GO條目注釋。注釋到的條目利用網(wǎng)頁(yè)版的WEGO(Jiaetal.，2006)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)并作圖。注釋得到所有GO分為三大類：細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過(guò)程。GO富集和KEGG通路富集分析利用KOBAS 2.0(Xieetal.，2011)網(wǎng)頁(yè)提交注釋的編碼蛋白質(zhì)序列執(zhí)行，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)利用卡方檢驗(yàn)，顯著水平設(shè)置為α=0.05，最終獲得GO富集條目和KEGG富集相關(guān)通路。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星類型和豐度

對(duì)微衛(wèi)星的重復(fù)類型和數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表1)。綠尾虹雉的全基因組中，6種完美型微衛(wèi)星總數(shù)為292 430個(gè)，總長(zhǎng)度達(dá)5 465 549 bp，占基因組的0.54%，相對(duì)豐度為290.47個(gè)/Mb。其中，數(shù)量和長(zhǎng)度最多的是單堿基類型，達(dá)209 830個(gè)(71.75%)，相對(duì)豐度為208.43個(gè)/Mb。其余微衛(wèi)星占比都小于10%，依次是四堿基(9.99%)、二堿基(7.07%)、三堿基(6.38%)、五堿基(3.93%)，最少的是六堿基(0.88%，相對(duì)豐度為2.56個(gè)/Mb)。

表1 綠尾虹雉基因組中完美型微衛(wèi)星分布概況Table 1 The perfect microsatellite types in Lophophorus lhuysii

2.2 不同類型微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)

綠尾虹雉不同類型微衛(wèi)星的重復(fù)次數(shù)分布差異較大，單堿基重復(fù)次數(shù)最多，主要為12～32次(71.75%)，12次最多，有39 900個(gè)；其余5種類型的重復(fù)次數(shù)和長(zhǎng)度都較低，均低于10%，主要為4～11次(圖1)。微衛(wèi)星偏倚十分明顯，主要集中在單堿基，其中，A最豐富，有195 729個(gè)，占66.93%，C相對(duì)較少，有14 101個(gè)，占4.82%；二堿基中，AT最多，有9 849個(gè)，占3.37%，其次是AC(2.56%)和AG(1.13%)，CG最少，僅有37個(gè)，占0.01%；三堿基中最多的是AAT，有5 535個(gè)，占1.89%；四堿基中AAAC和AAAT最多，分別占3.81%和2.80%；五堿基中AAAAC最多，占1.07%(表2，圖2)。

2.3 微衛(wèi)星定位在外顯子中的編碼基因功能注釋

對(duì)微衛(wèi)星進(jìn)行全基因組定位，其中，分布于外顯子的有2 816個(gè)，分布于1 314個(gè)編碼基因中，數(shù)量最少，只占0.96%；分布于內(nèi)含子和基因間區(qū)的數(shù)量龐大，分別有101 791個(gè)(34.81%)和187 823個(gè)(64.23%)。外顯子是編碼蛋白的翻譯區(qū)，對(duì)基因行使的功能具有重要作用，所以對(duì)在外顯子中定位到微衛(wèi)星的編碼基因進(jìn)行了GO和KEGG注釋分析。

2.3.1GO注釋和富集分析GO注釋主要分為三大類：細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過(guò)程(圖3)。所得GO條目為599個(gè)，分布于695個(gè)基因中。WEGO分析發(fā)現(xiàn)，268個(gè)歸于細(xì)胞部分，135個(gè)與分子功能有關(guān)，196個(gè)參與到生物學(xué)過(guò)程中。細(xì)胞組分中主要與細(xì)胞和細(xì)胞部分(GO：0005623，GO：0044464)有關(guān)，分子功能中主要與連接(GO：0005488)有關(guān)，生物學(xué)過(guò)程中主要與細(xì)胞過(guò)程和代謝過(guò)程(GO：0009987，GO：0008152)有關(guān)。GO條目富集前10的主要與代謝、合成過(guò)程和轉(zhuǎn)錄有關(guān)，其中，RNA代謝過(guò)程富集最顯著(P=7.92E-16)，有122個(gè)(表3)。

2.3.2KEGG注釋和富集分析對(duì)綠尾虹雉外顯子中含有微衛(wèi)星的基因進(jìn)行KEGG注釋，得到903個(gè)KO number，將這些條目進(jìn)行富集分析，富集到了14個(gè)通路中。這些通路中，黏著連接富集最顯著，有14個(gè)基因，P值為2.03E-04；黏著斑的基因總數(shù)最多，有21個(gè)，P值為5.11E-03。將這些通路進(jìn)行功能分類，主要分為機(jī)體系統(tǒng)、細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病和代謝。其中，環(huán)境信息處理相關(guān)的通路最多，7個(gè)通路含有80個(gè)基因；其次是細(xì)胞過(guò)程，2個(gè)通路含有35個(gè)基因；機(jī)體系統(tǒng)的最少，只有1個(gè)通路6個(gè)基因(表4)。

3 討論

利用全基因組數(shù)據(jù)對(duì)綠尾虹雉微衛(wèi)星序列進(jìn)行鑒定和分類注釋，可為其分子標(biāo)記和種群遺傳多樣性研究等提供有用信息。本文對(duì)綠尾虹雉全基因組微衛(wèi)星進(jìn)行了搜索分析，1.01 Gb基因組中完美型微衛(wèi)星292 430個(gè)，長(zhǎng)度主要在10～43 bp，總長(zhǎng)度5 465 549 bp，占全基因組的0.54%，相對(duì)豐度290.47個(gè)/Mb。雉科鳥(niǎo)類中，紅原雞Gallusgallus共有28 272個(gè)微衛(wèi)星(0.49%)(黃杰等，2012)，火雞Meleagrisgallopavo有177 733個(gè)(0.28%)(李午佼等，2012)。與人類3%微衛(wèi)星含量(Subramanianetal.，2003)相比，綠尾虹雉等雉科鳥(niǎo)類的微衛(wèi)星數(shù)量較少，這或許與哺乳動(dòng)物基因組較大且重復(fù)序列較多有關(guān)。人類基因組大小為2.91 Gb，重復(fù)序列占基因組的66%～69%(Koningetal.，2011)，而鳥(niǎo)類基因組較小且重復(fù)序列少，如綠尾虹雉基因組中重復(fù)序列只占9.9%。這些證據(jù)說(shuō)明，人類基因組會(huì)有相對(duì)較多的微衛(wèi)星。在所有微衛(wèi)星類型中，綠尾虹雉的單堿基型微衛(wèi)星最多，達(dá)71.75%，其中An含量最高(66.93%)。該結(jié)果與紅原雞相似，都以An和Tn為主，單堿基占65.1%(黃杰等，2012)。重復(fù)單位增加，微衛(wèi)星位點(diǎn)的總數(shù)會(huì)相應(yīng)減少(Bennett，2000)。在許多動(dòng)植物中，都表現(xiàn)出微衛(wèi)星A和T堿基偏倚，如紅原雞(黃杰等，2012)、核桃Juglansregia(廖卓毅，2015)、林麝Moschusberezovskii(盧婷等，2017)、虎皮鸚鵡Melopsittacusundulatus(黃杰等，2017)和天麻Gastrodiaelata(周天華等，2017)等。真核生物中普遍存在的ployA(Gallie，1991)或許是大部分物種全基因組微衛(wèi)星預(yù)測(cè)結(jié)果表現(xiàn)強(qiáng)烈偏倚的原因，此外，真核生物非編碼區(qū)的CpG島易被甲基化(Bird，1986)，或也與這種偏倚有關(guān)。此外，綠尾虹雉和其他幾種雉科鳥(niǎo)類比其他物種有較明顯的A堿基偏倚，重復(fù)次數(shù)最多的重復(fù)單元類型分別是A、AT、AAT、AAAC，這種雉科鳥(niǎo)類普遍特點(diǎn)也有待深入研究。

圖1 綠尾虹雉中各重復(fù)單元微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)分布Fig. 1 Repeat distribution of each microsatellite type in Lophophorus lhuysii

圖2 綠尾虹雉全基因組中相對(duì)豐度最高的微衛(wèi)星基序分布Fig. 2 Relative abundance of the most relative abundant microsatellite motifs in the genome of Lophophorus lhuysii

圖3 綠尾虹雉微衛(wèi)星分布于外顯子的基因GO功能注釋Fig. 3 The GO function annotation of exon microsatellites in Lophophorus lhuysii

表4 綠尾虹雉微衛(wèi)星分布于外顯子的基因KEGG富集Table 4 The KEGG enrichment of exon microsatellites in Lophophorus lhuysii

外顯子區(qū)是重要的表達(dá)區(qū)域，本文對(duì)綠尾虹雉微衛(wèi)星進(jìn)行了外顯子定位分析，發(fā)現(xiàn)外顯子中有2 816個(gè)(0.96%)微衛(wèi)星，分布于1 314個(gè)編碼基因中。GO注釋到695個(gè)基因中，其中涉及較多關(guān)于細(xì)胞和細(xì)胞部分，富集前10的條目主要與代謝、合成過(guò)程和轉(zhuǎn)錄有關(guān)。KEGG富集到14個(gè)通路中，其中最顯著富集到黏著連接通路，而大分類下環(huán)境信息處理?xiàng)l目最多。微衛(wèi)星屬于不穩(wěn)定DNA序列，易發(fā)生擴(kuò)增，而位于外顯子中的微衛(wèi)星發(fā)生移碼突變可能會(huì)造成基因突變，而這些基因又與綠尾虹雉處理環(huán)境信息、代謝和細(xì)胞的基本組分息息相關(guān)，若發(fā)生突變可能會(huì)使這些信號(hào)通路的信息傳遞和一些物質(zhì)的代謝過(guò)程受到影響。

微衛(wèi)星在真核生物中分布多、分類廣，有著多方面的用途：可用于個(gè)體識(shí)別和親緣鑒定；是一種常用的遺傳標(biāo)記，可用于研究遺傳多態(tài)性揭示物種的起源、遷徙和進(jìn)化等；也可用于遺傳病腫瘤診斷等醫(yī)學(xué)有關(guān)用途(張?jiān)莆涞龋?001)。本文利用軟件預(yù)測(cè)首次對(duì)綠尾虹雉的全基因組微衛(wèi)星進(jìn)行了搜索鑒定，并對(duì)其分布規(guī)律進(jìn)行了探究，為后續(xù)的微衛(wèi)星篩選提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。