江 健， 廖莉婭， 容 嬋， 陳捷僑， Ashish SHRESTHA， 劉星琦， 蘇 雅， 舒曉春△

(1中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院， 廣東 珠海 519000； 2南方醫(yī)科大學(xué)附屬順德醫(yī)院， 廣東 佛山 528300)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)是最常見的代謝性骨骼疾病，其特點(diǎn)是骨量減低，骨質(zhì)強(qiáng)度減弱，骨微結(jié)構(gòu)破壞，從而骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加[1]。隨著人口老齡化的不斷增加，我國作為世界上老年人口絕對數(shù)最大的國家，正面臨著骨質(zhì)疏松癥高患病率的嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國50歲以上人群骨質(zhì)疏松癥患病率女性為20.7%，男性為14.4%[2]。目前治療骨質(zhì)疏松癥的藥物主要是抑制骨吸收藥物，包括雙膦酸鹽、降鈣素和雌激素[3]。然而，有研究表明這些藥物的使用可能引起一些副作用，包括骨壞死、非典型股骨骨折和食道癌等[4]。因此，探索更加安全、健康的天然藥物來治療骨質(zhì)疏松顯得尤為重要，已有研究發(fā)現(xiàn)一些天然藥物，如骨碎補(bǔ)總黃酮、淫羊藿苷和鹽酸小檗堿等都有促進(jìn)成骨分化和抗骨質(zhì)疏松的潛能[5-7]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)通路是與新陳代謝、增殖、分化及凋亡關(guān)系密切的信號通路[8]，蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)是PI3K激活的主要信號分子，它隨后通過磷酸化對下游的多種物質(zhì)產(chǎn)生作用[9]。此外，PI3K/Akt信號通路在成骨和破骨細(xì)胞的形成、分化以及氧化損傷的調(diào)節(jié)中起著重要作用[10-13]。鹽酸小檗堿(berberine，BBR)是一種生物堿，如今，關(guān)于BBR促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用機(jī)制仍不是十分清楚。本研究通過探討B(tài)BR對前成骨細(xì)胞分化與礦化的影響，檢測成骨細(xì)胞相關(guān)分化分子的表達(dá)情況，并探討其機(jī)制是否與BBR激活PI3K/Akt信號通路有關(guān)，為進(jìn)一步促進(jìn)黃連素的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細(xì)胞 小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1由南方醫(yī)科大學(xué)提供。

1.2藥物和主要試劑 鹽酸小檗堿(純度>98%)購于東京化成工業(yè)株式會社；PI3K/Akt 信號通路特異性抑制劑LY294002(碧云天生物公司)；α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco)；四季青胎牛血清(浙江天航生物科技有限公司)； CCK-8試劑盒(同仁化學(xué)研究所)；BCA蛋白檢測試劑盒(凱基生物公司)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性檢測試劑盒(南京建成生物公司)；real-time PCR所用引物及定量檢測SYBR Green(上海生物工程公司);茜素紅S染液(翔博生物公司)；抗體β-actin (Santa Cruz);抗體p-Akt(CST)；羊抗小鼠及羊抗兔Ⅱ抗(Abclonal)；極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物公司)。

2 主要方法

2.1前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇后加入4 mL完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液一次，顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況，待細(xì)胞生長融合到80%后，PBS洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶2 mL，37 ℃靜置1 min, 加入4 mL完全培養(yǎng)基終止消化，800 r/min離心5 min，棄上清, 加入4 mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到培養(yǎng)瓶中，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

2.2細(xì)胞活性測定 細(xì)胞接種在96孔板中，密度為每孔3 000個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞基本融合后，采用不同濃度(0,1,5,10和20 mg/L)的鹽酸小檗堿進(jìn)行干預(yù)，3 d后，使用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性。每孔加入含10% CCK-8試劑的培養(yǎng)基100 μL，37 ℃孵育4 h，酶標(biāo)儀選擇450 nm波長檢測其吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞活性，結(jié)果用與對照組的百分比表示。

2.3堿性磷酸酶活性的測定 MC3T3-E1細(xì)胞按1×108cells/L的密度接種2 mL于6孔板中，待細(xì)胞融合至80%，加不同濃度(0、1、5、10和20 mg/L)的鹽酸小檗堿分別培養(yǎng)3 d和7 d，每2 d更換一次培養(yǎng)基。測定步驟參照ALP檢測試劑盒提供的方法：棄除培養(yǎng)基后，PBS清洗2遍，加入含有1% Triton X-100的細(xì)胞裂解200 μL，冰上裂解30 min，低溫離心機(jī)4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取上清液用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度，用ALP檢測試劑盒在酶標(biāo)儀波長520 nm處檢測其A值，計(jì)算堿性磷酸酶活性。

2.4成骨細(xì)胞分化相關(guān)因子mRNA水平表達(dá)情況的測定 成骨細(xì)胞分化相關(guān)因子ALP、骨鈣素(osteocalcin， OCN)、骨橋蛋白(osteopontin， OPN)及Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2， Runx2)是成骨分化實(shí)驗(yàn)重要的檢測指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)將前成骨細(xì)胞按1×108cells/L密度接種2 mL于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞基本融合后，實(shí)驗(yàn)分為對照(control)組，BBR組，BBR+LY249002組和LY249002組，BBR+LY249002組及LY249002組加入含抑制劑(10 mmol/L LY294002)的無血清培養(yǎng)基預(yù)處理1 h，吸凈培養(yǎng)液，后分別加入含藥(5 mg/L BBR)培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，后用PBS洗2遍，加入200 μL TRIzol reagent提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa，每10 μL的逆轉(zhuǎn)錄體系含總RNA 600 ng。Real-time PCR分析采用SYBR Green real-time PCR試劑盒，引物如表1所示，反應(yīng)條件： 95 ℃ 3 min; 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參照，數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。

表1 Real-time PCR引物序列

2.5Western blot檢測PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞按1×108cells/L的密度接種4 mL于直徑為60 mm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合至80%后，對各實(shí)驗(yàn)組(對照組、BBR組、BBR+LY249002組和LY249002組)做相應(yīng)的處理，藥物干預(yù)48 h后，用PBS洗2遍，加入200 μL的細(xì)胞蛋白裂解液(含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑)，冰上裂解30 min。4 ℃、12 000×g離心15 min，收集上清液。用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液在100 ℃加熱10 min進(jìn)行蛋白變性。每孔加入等量的蛋白質(zhì)(10 μg)進(jìn)行10% SDS-PACE，200 mA轉(zhuǎn)膜120 min。QuickBlockTM封閉液封閉30 min，加入Ⅰ抗4 ℃條件下孵育過夜，TBST洗膜3次，首次15 min，其余10 min，加入Ⅱ抗孵育1 h,TBST清洗3次。用ECL進(jìn)行發(fā)光顯影，通過蛋白條帶灰度分析進(jìn)行定量測定。

2.6茜素紅S染色及半定量測定 MC3T3-E1細(xì)胞按2×107cells/L的密度接種1 mL于24孔板中，普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分為4個(gè)處理組(對照組、BBR組、BBR+LY249002組和LY249002組)，經(jīng)過藥物和抑制劑處理以后加入細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 mg/L抗壞血酸)培養(yǎng)21 d，培養(yǎng)基每2 d換一次，誘導(dǎo)分化完成后，PBS沖洗2遍，用70%乙醇固定1 h，后PBS沖洗3遍，用茜素紅S染液(40 mmol/L,pH 4.2)37 ℃染色1 h。染色完成后用無鈣、鎂離子的PBS沖洗5遍，顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。用100 nmol/L的氯化十六烷基吡啶溶液溶解染色后的礦化結(jié)節(jié)，并用酶標(biāo)儀在波長為540 nmol/L處測定各實(shí)驗(yàn)組的A值。

3 統(tǒng)計(jì)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 鹽酸小檗堿在一定濃度內(nèi)對MC3T3-E1細(xì)胞活性無影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，不同濃度鹽酸小檗堿干預(yù)后，細(xì)胞活性沒有明顯差異，見圖1。

Figure 1.Effects of BBR at different concentrations on the viabi-lity of MC3T3-E1 cells. Mean±SD.n=3.

圖1不同濃度鹽酸小檗堿對MC3T3-E1細(xì)胞活性的影響

2 鹽酸小檗堿增加前成骨細(xì)胞ALP活性

MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)不同濃度的鹽酸小檗堿培養(yǎng)3 d后，5 mg/L BBR組的ALP活性明顯高于對照組(P<0.01)；加藥培養(yǎng)7 d，與對照組相比，不同濃度BBR組的ALP活性都有增加，其中5 mg/L BBR組的ALP活性最高，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中BBR組均采用5 mg/L這一濃度，見圖2。

Figure 2.Effects of BBR at different concentrations on ALP activity in MC3T3-E1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vs0 mg/L group at the same time.

圖2不同濃度鹽酸小檗堿對MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性的影響

3 鹽酸小檗堿促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化相關(guān)因子的表達(dá)，其作用被LY249002抑制

與對照組相比，BBR處理顯著提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞ALP、OCN、OPN和Runx2的mRNA表達(dá)(P均<0.01)；與BBR處理組相比，BBR+LY294002組與LY294002組的成骨分化相關(guān)因子的mRNA表達(dá)均明顯減低(P<0.01)，見圖3。

4 鹽酸小檗堿促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞p-Akt蛋白的表達(dá)，其作用被LY249002抑制

Western blot分析顯示，與對照組相比，BBR組p-Akt蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01)，而BBR+LY294002組與LY294002組p-Akt的表達(dá)均明顯降低(P<0.01),見圖4。說明鹽酸小檗堿能促進(jìn)Akt磷酸化，激活PI3K/Akt信號通路，而LY294002能抑制鹽酸小檗堿對PI3K/Akt信號通路的激活作用。

Figure 3.Effects of BBR and PI3K/Akt pathway inhibitor LY249002 (LY) on the mRNA expression of the molecules related to osteogenic differentiation in MC3T3-E1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05，##P<0.01vsBBR group.

圖3鹽酸小檗堿與PI3K/Akt信號通路抑制劑LY249002對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

5 鹽酸小檗堿促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的礦化，其作用被LY249002抑制

經(jīng)礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d，茜素紅S染色后礦化結(jié)節(jié)呈紅色。與對照組相比，BBR組鈣結(jié)節(jié)形成明顯；與BBR處理相比，BBR+LY294002組及抑制劑LY294002處理組細(xì)胞鈣沉積面積明顯減少。溶解礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行定量分析，檢測數(shù)據(jù)表明，BBR組礦化結(jié)節(jié)溶解液的吸光度明顯高于對照組；BBR+LY294002組及LY294002處理組礦化結(jié)節(jié)溶解液的吸光度明顯低于BBR組(P<0.01)，見圖5。這說明鹽酸小檗堿能促進(jìn)前成骨細(xì)胞的礦化，而LY294002能抑制鹽酸小檗堿促進(jìn)前成骨細(xì)胞的礦化作用。

Figure 4.Effects of BBR and PI3K/Akt pathway inhibitor LY249002(LY) on the expression of p-Akt protein associated with PI3K/Akt signaling pathway in MC3T3-E1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsBBR group.

圖4鹽酸小檗堿與PI3K/Akt信號通路抑制劑LY249002對MC3T3-E1細(xì)胞PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白p-Akt表達(dá)的影響

Figure 5.Effects of BBR and PI3K/Akt pathway inhibitor LY249002(LY) on mineralization of MC3T3-E1 cells (alizarin red S staining, ×40). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsBBR group.

圖5鹽酸小檗堿與PI3K/Akt信號通路抑制劑LY249002對MC3T3-E1細(xì)胞礦化的影響

討 論

骨質(zhì)疏松癥是全球范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的公共健康問題，其防治與愈后也受到國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注，然而，目前用于治療骨質(zhì)疏松的藥物存在一定的副作用，以及療效受其他藥物影響，從而一定程度上限制其使用。因此尋求和研發(fā)安全，有效的抗骨質(zhì)疏松藥物是目前亟待解決的問題。

BBR是一種從中草藥中分離出來的異喹啉類生物堿[14]，具有多種藥理作用，包括抗菌[15]、抗腫瘤[16]、抗炎[17]、抗氧化及抗凋亡[18]等，最新研究發(fā)現(xiàn)BBR可在抗骨質(zhì)疏松中發(fā)揮重要作用[19]。有研究表明BBR可通過介導(dǎo)p38 MAPK/Runx2信號通路直接促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的成骨分化[5]。另一項(xiàng)研究指出，BBR不僅可以通過增強(qiáng)Runx2的表達(dá)，還可以通過激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路來刺激MSCs的成骨分化[20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)BBR可能通過激活前成骨MC3T3-E1細(xì)胞中的PI3K/Akt信號通路，從而促進(jìn)前成骨細(xì)胞的分化和鈣化。為闡明BBR對前成骨細(xì)胞分化的調(diào)控作用，我們檢測了不同濃度BBR對前成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響，此外，本實(shí)驗(yàn)還對成骨細(xì)胞分化相關(guān)分子ALP、OCN、OPN和Runx2進(jìn)行了研究。成骨細(xì)胞分化相關(guān)分子中, Runx2屬于轉(zhuǎn)錄因子Runx家族成員，是成骨細(xì)胞分化和骨形成最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子之一[21],它可以有效地啟動主要骨基質(zhì)蛋白基因的表達(dá)。

據(jù)報(bào)道,Runx2能夠改善PI3K信號通路的活性,增加p85、p110β和Akt的蛋白表達(dá)，同時(shí)PI3K/Akt信號通路又可以改善Runx2和Runx2轉(zhuǎn)錄所依賴的DNA分子結(jié)合[22]，它們在成骨細(xì)胞分化調(diào)控中相互依賴。此外，Runx2可以通過與啟動子結(jié)合，上調(diào)成骨基因OPN和OCN的表達(dá)來調(diào)控成骨細(xì)胞的分化[23]。成骨細(xì)胞分化過程分為2個(gè)階段，在第一階段，ALP的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞分化，ALP是成骨細(xì)胞分化早期最常用的標(biāo)志物之一，同時(shí)它也是一種重要的酶，能催化和上調(diào)成骨細(xì)胞分化基因OPN的表達(dá)[24]；在第二階段，通過鈣沉積而使基體礦化，在原始軟骨周圍形成一層海綿狀的骨組織，然后海綿狀骨充滿骨基質(zhì)，成為致密骨，從而增進(jìn)骨的鈣化使硬度增加[25]。因此，ALP活性作為早期分化標(biāo)志物，OCN是成骨細(xì)胞分化的終末標(biāo)志，代表成骨細(xì)胞的成熟和基質(zhì)礦化過程。本研究發(fā)現(xiàn)，BBR有明顯增強(qiáng)MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性與增加MC3T3-E1細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成的作用，在藥物濃度為5 mg/L時(shí)作用最為明顯。Real-time PCR分析顯示，BBR增加了ALP、OPN、OCN和RUNX2的mRNA表達(dá)。然而，PI3K/Akt抑制劑LY294002抑制了該藥物的促進(jìn)作用，表明BBR刺激MC3T3-E1成骨分化的能力可能通過PI3K/Akt信號通路參與調(diào)節(jié)。

PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞增殖、分化、黏附和凋亡中起著重要作用[26]。Akt是PI3K/Akt信號通路的關(guān)鍵蛋白之一，作為PI3K下游關(guān)鍵的激酶，是細(xì)胞增殖、生長和存活的主要介導(dǎo)因子[27]。p-Akt作為Akt激活后的介導(dǎo)物質(zhì)，通過激活PI3K/Akt信號通路下游的動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)，從而干擾細(xì)胞凋亡并促進(jìn)增殖和運(yùn)動[28]。PI3K/Akt信號通路在神經(jīng)細(xì)胞以及心肌細(xì)胞缺血保護(hù)中起著重要作用[29]。此外，許多研究表明PI3K/Akt信號通路與骨組織代謝之間存在密切關(guān)系, 在成骨細(xì)胞中，活化PI3K/Akt信號通路能刺激細(xì)胞的增殖和分化，同時(shí)也能抑制細(xì)胞凋亡[30]。在治療骨質(zhì)疏松癥的藥物中，很多藥物的作用通過對PI3K/Akt通路的調(diào)控來完成，如丹參素通過活化P13k/Akt通路減少骨質(zhì)疏松大鼠中成骨細(xì)胞的凋亡[31]；淫羊藿苷通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路對糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松癥具有一定的防治作用[6]。為了探究PI3K/Akt通路是否在BBR促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分化和礦化過程中起著重要作用，我們在MC3T3-E1細(xì)胞干預(yù)中使用PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002,Western blot結(jié)果表明與對照組相比，BBR組促進(jìn)了MC3T3-E1細(xì)胞p-Akt蛋白的表達(dá)，而LY294002預(yù)處組p-Akt蛋白的表達(dá)明顯下降。同樣，LY294002預(yù)處理組，ALP、OCN、OPN和Runx-2的mRNA表達(dá)也有明顯下降趨勢，但BBR組的mRNA表達(dá)明顯增加。這些結(jié)果表明PI3K/Akt通路可能在BBR對MC3T3-E1細(xì)胞的分化和鈣化的調(diào)控中起著重要作用。

綜上所述，BBR具有促進(jìn)前成骨細(xì)胞分化和礦化的作用，其作用機(jī)制可能是通過激活PI3K/Akt信號通路來完成。因此，BBR有治療骨質(zhì)疏松癥的潛能，為臨床使用BBR治療骨質(zhì)疏松提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但該信號通路下游的調(diào)節(jié)機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。