陸玉蘭， 劉純宏， 王 榮， 黃華佗， 曾永龍， 韋葉生△， 藍(lán) 艷

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1檢驗(yàn)科， 2皮膚科， 廣西 百色 533000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種的常見自身免疫性疾病，臨床上常累及機(jī)體多器官臟器，病程遷延反復(fù)。近年來，我國(guó)SLE的患病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給社會(huì)和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。然而，SLE的病因及發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明。流行病學(xué)研究表明，SLE是一種由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用而導(dǎo)致的復(fù)雜疾病，其中遺傳因素在SLE的發(fā)病過程中起著重要的作用[2]。S100鈣結(jié)合蛋白B(S100 calcium-binding protein B, S100B)屬于S100超家族的成員之一，廣泛表達(dá)于機(jī)體多種組織和細(xì)胞表面。最近研究發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的S100B蛋白與多種免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-6]。此外，已有研究表明S100B基因位點(diǎn)突變可以促進(jìn)血清S100B蛋白水平的表達(dá)[7-8]。然而，S100B基因突變是否與SLE的發(fā)生具有相關(guān)性，目前尚未有報(bào)道。因此，本研究通過病例-對(duì)照研究，探討S100B基因多態(tài)性與SLE及其臨床表現(xiàn)的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明遺傳易感基因在SLE發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供有利依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 對(duì)象

1.1SLE組 選取2013年1月～2016年9月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院被皮膚科確診的SLE患者313例。SLE的診斷符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂的SLE分類診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2對(duì)照組 選取2013年1月～2016年9月到右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院進(jìn)行體檢的體檢者396例，均無感染性疾病史、神經(jīng)系統(tǒng)病變史、自身免疫性疾病史和嚴(yán)重心肝腎等重要臟器功能不全等。研究對(duì)象均來自廣西地區(qū)人群。該研究由右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均已簽署知情同意書。

1.3臨床基本資料 利用醫(yī)院的病例管理系統(tǒng)收集已確認(rèn)為SLE患者的臨床基本資料，主要包括年齡、性別、顴部紅斑、光過敏、胸膜炎、關(guān)節(jié)炎、腎炎和神經(jīng)系統(tǒng)病變等。

2 方法

2.1基因組DNA的提取 采集受試者靜脈血3.0 mL，用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝。采用離心柱法(北京天根公司)提取基因組DNA，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的S100B基因序列，選擇包含rs9984765、rs2839356 和rs2186358位點(diǎn)的堿基，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，引物由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特異性擴(kuò)增S100B基因3個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)堿基的DNA片段引物序列見表1。

2.3PCR擴(kuò)增 采用20 μL反應(yīng)體系，其中包括2 μL緩沖液(1×GC-I buffer; TaKaRa)、2 μL Mg2+(3 mmol/L)、2 μL dNTP (0.3 mmol/L)、1 U HotStar Taq 聚合酶(Qiagen)、1 μL 多重PCR引物(20 μmol/L)和1 μL DNA模板 (0.2 μg)，余下體積用經(jīng)過嚴(yán)格高壓滅菌的雙蒸水補(bǔ)足。PCR參數(shù)為95 ℃預(yù)變性2 min；擴(kuò)增階段為94 ℃預(yù)變性20 s、65 ℃退火40 s、72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)11次；94 ℃預(yù)變性20 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)24次；最后階段72 ℃延長(zhǎng)2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP; Promega)和外切酶I(Epicentre)純化后用ABI的SNaPshot Multiplex kit進(jìn)行延伸反應(yīng)。延伸產(chǎn)物用SAP純化后在ABI 3730xl上樣。SNP分型用GeneMapper 4.1軟件來分析。

表1S100B基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的PCR引物序列

Table 1.The primer sequences used for detecting the 3 SNP sites ofS100Bgene

SNP sitePrimer sequence (5’-3’)rs9984765F: CTCCACAGAGCCTCCTGCAAAGR: CCTGGCACATGGATGAATGACCEF: TTTTTTTTTTTTACCATGACTGGCTTAACTGAGGrs2839356F: TCACCTTCAGGGCAGCTGAGAAR: TGGAAGGGAGGGAGACAAGCACEF: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAGATAAAGCCAGTGTACAGATGGATrs2186358F: GACATCCTAGGGGCTCGCAAAGR: CCCCTTGTCTGGGTTGAGGTCTEF: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGTTGCCTTCTCATCTATACCTCATC

F: forward； R: reverse； EF: extension primer.

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件計(jì)算，采用Hardy-Weinberg平衡定律評(píng)估該研究樣本的群體代表性。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用t檢驗(yàn)；分類變量采用2檢驗(yàn)。采用logistic 回歸方法計(jì)算優(yōu)勢(shì)比(odds ratio, OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval, CI),評(píng)估各位點(diǎn)基因多態(tài)性與SLE易感性的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 S100B基因SNP分型結(jié)果

SNP分型結(jié)果顯示，rs9984765存在TT、CT和CC基因型，rs2839356存在TT、CT和CC基因型，rs2186358存在AA、AC和CC基因型，DNA測(cè)序法驗(yàn)證了上述的分型結(jié)果，見圖1。

2 研究對(duì)象的基本臨床資料

本研究共納入符合條件的SLE患者組313例，年齡為(38.05±12.93)歲，其中男性63例(20.13%)，女性250例(79.87%)；對(duì)照組396例，年齡為(39.48±12.10)歲，其中男性98例(24.75%)，女性298例(75.25%)。年齡和性別在病例組和對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表2。

Figure 1.The sequencing map ofS100Bgene rs9984765, rs2839356 and rs2186358. A: ①, ② and ③ were the sequencing map of TT, CT and CC genotypes for rs9984765; B: ①, ② and ③ were the sequencing map of TT, CT and CC genotypes for rs2839356; C: ①, ② and ③ were the sequencing map of AA, AC and CC genotypes for rs2186358. The arrows were loci of genetic mutations.

圖1S100B基因rs9984765、rs2839356和rs2186358位點(diǎn)的測(cè)序圖

表2 SLE患者組和對(duì)照組的臨床基本資料

3 S100B基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性的相關(guān)性分析

S100B基因rs9984765、rs2839356和rs2186358位點(diǎn)的基因型在對(duì)照組中分布均符合Hardy-Weinberg平衡。在SLE患者組和對(duì)照組中，比較S100B基因rs9984765、rs2839356和rs2186358位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的分布情況。經(jīng)logistic回歸方法分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs9984765和rs2186358位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在SLE患者組和對(duì)照組間分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，然而rs2839356位點(diǎn)等位基因C與G比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.040)，見表3。

表3 S100B基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的遺傳易感性

HWE: Hardy-Weinberg equilibrium; Ref: reference.

4 S100B基因多態(tài)性與SLE患者的臨床表現(xiàn)

SLE 患者臨床表現(xiàn)復(fù)雜，因此我們進(jìn)一步分析了S100B基因3個(gè)位點(diǎn)的等位基因與SLE患者常見臨床表現(xiàn)的關(guān)系。結(jié)果顯示，rs2839356位點(diǎn)C等位基因頻率在伴有神經(jīng)系統(tǒng)病變的SLE患者中(47.2%)高于不伴有神經(jīng)系統(tǒng)病變的SLE患者(36.6%)，而rs2839356位點(diǎn)C等位基因在是否伴有顴部紅斑、光過敏、胸膜炎、關(guān)節(jié)炎和腎炎的SLE患者間分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表4。

表4 rs2839356等位基因與SLE患者臨床表現(xiàn)的關(guān)系

+: positive; -: negative.

討 論

S100B屬于S100蛋白超家族中活性最強(qiáng)的成員，相對(duì)分子質(zhì)量為21 kD，是一種主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的酸性鈣結(jié)合蛋白。最近有研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞亞群等也可以分泌S100B[9]。S100B蛋白具有多樣的生物學(xué)功能，如調(diào)控細(xì)胞的增殖與分化、參與細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡等[10]；此外，S100B蛋白可以通過與晚期糖基化產(chǎn)物受體結(jié)合后激活一系列細(xì)胞信號(hào)通路，刺激白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β， IL-1β)、IL-6、干擾素γ和腫瘤壞死因子α等多種炎癥因子的釋放[11-12]，而這些炎癥因子在SLE的發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用。同時(shí)，有研究表明S100B與RAGE相互作用可以激活核因子κB及其下游P38絲裂原激活蛋白激酶信號(hào)通路，從而參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞的免疫過程[13]。結(jié)合S100B基因位點(diǎn)突變可以促進(jìn)血清S100B蛋白水平的表達(dá)以及S100B蛋白在多種免疫炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要的角色，我們推測(cè)S100B基因多態(tài)性可能與SLE的發(fā)病機(jī)制有關(guān)聯(lián)。

S100B基因定位于人類21號(hào)染色體q22.2～q22.3區(qū)域，主要由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，其mRNA長(zhǎng)度為1 095 bp，編碼91個(gè)氨基酸。近年來，越來越多的研究報(bào)道S100B基因突變與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Dagdan等[14]研究發(fā)現(xiàn)rs3788266位點(diǎn)可能是雙向情感障礙患者的易感基因，而且該位點(diǎn)的G等位基因與血清S100B及其mRNA的高度表達(dá)具有相關(guān)性。Matsson等[15]研究表明rs9722的T等位基因可能是閱讀障礙癥患者的易感等位基因。李晶等[16]研究發(fā)現(xiàn)rs9722的T等位基因可能與腸道病毒71型(EV71)感染的手足口病有關(guān)聯(lián)。Dix等[17]研究發(fā)現(xiàn)S100B基因突變與侵襲性曲霉病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前，關(guān)于S100B基因多態(tài)性與SLE的遺傳易感性尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)S100B基因rs9984765和rs2186358位點(diǎn)基因型和等位基因在SLE患者組和對(duì)照組中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而rs2839356位點(diǎn)的C等位基因攜帶者與SLE之間的存在相關(guān)性，即SLE患者組攜帶C等位基因頻率高于對(duì)照組。同時(shí)，進(jìn)一步分析rs2839356等位基因與SLE患者臨床表現(xiàn)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)rs2839356位點(diǎn)C等位基因頻率在伴有神經(jīng)系統(tǒng)病變的SLE患者中高于不伴有神經(jīng)系統(tǒng)病變的SLE患者。我們的研究結(jié)果提示rs2839356位點(diǎn)C等位基因可能在廣西地區(qū)人群中與并發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)病變的SLE患者的易感性相關(guān)。由于樣本量、種族以及地域是影響基因多態(tài)性與疾病易感性的重要因素，而且，SLE 是一種由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的復(fù)雜疾病，由于缺乏足夠的有效數(shù)據(jù)，尚不能開展基因-基因間或基因-環(huán)境間的交互作用的探索，因此，下一步我們將對(duì)S100B基因SNP與SLE相關(guān)在其他種族人群、更大樣本量以及基因多態(tài)性與研究環(huán)境交互作用的廣泛研究中驗(yàn)證我們的結(jié)果。

綜上所述，本研究表明S100B基因rs9984765和rs2186358位點(diǎn)多態(tài)性可能與SLE的易感性無關(guān)，而rs2839356的C等位基因可能與SLE及其并發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)病變的風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性。其機(jī)理可能是該位點(diǎn)基因突變影響了血清S100B的分泌，參與了SLE的發(fā)生、發(fā)展過程。探究 S100B基因多態(tài)性在SLE發(fā)病過程中的具體機(jī)制，有助于闡明SLE發(fā)病分子機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)新的預(yù)測(cè)評(píng)估SLE危險(xiǎn)的基因標(biāo)志，進(jìn)一步為臨床上SLE的診斷、治療以及預(yù)后提供重要的理論依據(jù)。