李培源，彭炳華，莫媛媛

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530001；2.廣西師范學(xué)院 化學(xué)與材料學(xué)院，廣西 南寧 530001；3.廣西南寧市第五十六中學(xué)，廣西 南寧 530001)

活性氧(ROS)是許多氧化還原過(guò)程中產(chǎn)生的主要自由基，它可能對(duì)生物分子(包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類和DNA)產(chǎn)生氧化損傷?；钚匝跤绊懟罴?xì)胞是許多慢性疾病的發(fā)病機(jī)制，如動(dòng)脈粥樣硬化、帕金森病、阿爾茨海默病、中風(fēng)、關(guān)節(jié)炎、慢性炎癥性疾病、癌癥和其他退行性疾病[1-3]。由于合成的抗氧化劑副作用多且有致癌風(fēng)險(xiǎn)，近年來(lái)科研工作者致力于尋找來(lái)源于植物的天然抗氧化劑[4-5]。細(xì)葉石仙桃(Pholidota cantonensis Rolfe)是蘭科石仙桃屬植物，根狀莖匍匐，分枝，產(chǎn)浙江、江西、福建、臺(tái)灣、湖南、廣東和廣西。《滇藥錄》：全草(假鱗莖)治瘡癤紅腫疼痛，火灼傷?！兑退幹尽啡葜喂钦郏P(guān)節(jié)脫位。細(xì)葉石仙桃作為一種常用的草藥，其抗氧化方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)冷浸法得到細(xì)葉石仙桃乙醇提取物，采用ABTS體系和還原能力體系，來(lái)評(píng)估其抗氧化能力，尋找新的天然抗氧化劑。

1 材料與儀器

UV1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析電子科技有限公司)。藥材購(gòu)于廣西百色，經(jīng)鑒定為蘭科石仙桃屬植物細(xì)葉石仙桃(Pholidota cantonensis Rolfe)。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于百靈威試劑公司(北京)。所有試劑均為分析純。

2 方法

2.1 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物制備

稱取20 g細(xì)葉石仙桃粉末，加入200 mL乙醇(95%)，冷浸72 h。重復(fù)上述操作3次，合并提取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得到細(xì)葉石仙桃乙醇提取物。

2.2 ABTS·+自由基清除能力測(cè)定

將2,2'-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)用蒸餾水配制成2 mmol/L溶液，取50 mL上述溶液與200 mL K2S2O8水溶液(70 mmol/L)混合均勻，避光放置12～16 h，得到ABTS·+溶液。用磷酸鹽緩沖液將ABTS·+溶液稀釋至吸光度為0.70±0.02(Abs=734 nm處)。將細(xì)葉石仙桃提取物用95%乙醇稀釋為7個(gè)不同濃度藥液，取一定量提取物藥液，加入1.9 mL ABTS·+溶液混勻，在1、3、5、10min時(shí)測(cè)其吸光度。ABTS·+自由基清除率(S%)計(jì)算公式如下：S=(A0-A)/A0，其中A0為ABTS·+溶液的吸光度，A為加藥液后的吸光度。

2.3 還原能力測(cè)定[5]

取細(xì)葉石仙桃乙醇提取物溶液0.2 mL，加入2.5 mL PBS溶液(pH值=7.4)，2.5 mL KFe(CN)4(1%)。上述混合物于50℃恒溫20min后，加入2.5 mL三氯乙酸溶液(10%)，離心10min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水，0.5 ml FeCl3(1%)，混勻。在700 nm處測(cè)定吸光度，以蒸餾水為參比。

2.4 總酚含量測(cè)定

2.4.1 Folin-Ciocalteu試劑的配制

稱取80 g鎢酸鈉和20 g鉬酸鈉于圓底燒瓶中，用560 mL蒸餾水溶解，加入40 mL磷酸溶液(85%)和80 mL濃鹽酸，文火回流10 h，然后加入12 g硫酸鋰及60 mL雙氧水，加熱沸騰15min至溶液呈亮黃色。冷卻，移入1000 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，貯于棕色瓶中。

2.4.2 總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確稱取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，用蒸餾水溶解并定容到250 mL，得到0.1 mg/mL的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取對(duì)照樣品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，加入1 mL Folin-Ciocalteau試劑，搖勻后加入3 mL 2% Na2CO3溶液，用蒸餾水定容到10 mL，室溫下反應(yīng)2 h后在760 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，推出回歸方程。

2.4.3 提取液中總酚含量的測(cè)定

將各提取物溶液測(cè)定吸光度，多次測(cè)量求平均值。根據(jù)回歸方程計(jì)算總酚的沒(méi)食子酸當(dāng)量，總酚含量以每克干物質(zhì)的沒(méi)食子酸當(dāng)量(mg)表示。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力

3.1.1 不同濃度提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力

圖1為細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力測(cè)定結(jié)果。在濃度為0.5 mg/mL時(shí)，提取物對(duì)ABTS自由基的清除率為44.7%，濃度增加到0.8和1.0 mg/mL時(shí)，清除率增加至64.0%和82.5%。當(dāng)濃度增加至2.0 mg/mL時(shí)，清除率增大到98.9%。可見(jiàn)，隨著藥液濃度增加，提取物對(duì)ABTS自由基的清除率增大。值得一提的是，在低濃度(0.2 mg/mL)時(shí)，細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)ABTS自由基表現(xiàn)出了一定的清除能力，清除率為23.3%。

圖1 不同濃度細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)ABTS 自由基的清除能力

3.1.2 不同時(shí)間下提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力

圖2 不同時(shí)間細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)ABTS 自由基的清除能力

圖2列出了不同時(shí)間細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)ABTS自由基的清除率。可見(jiàn)，隨著作用時(shí)間增加，細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)ABTS自由基的清除率增加。濃度為1.5 mg/mL的提取物，在1min時(shí)的清除率為75.0%，在3和5min時(shí)清除率增加為85.0%和89.0%，在10min時(shí)ABTS自由基的清除率增加至94.9%。

3.1.3 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)ABTS自由基的EC50值

EC50代表抗氧化劑對(duì)自由基達(dá)到半抑制時(shí)的質(zhì)量濃度。EC50的數(shù)值越大，則表明抗氧化劑對(duì)自由基的清除能力越強(qiáng)。細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)ABTS自由基的EC50值為0.58 mg/mL，表明該提取物對(duì)于ABTS自由基的清除能力很強(qiáng)。

3.2 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物的還原能力

圖3表示細(xì)葉石仙桃乙醇提取物的還原能力，測(cè)定結(jié)果以吸光度表示，吸光度越高表示還原能力越強(qiáng)。細(xì)葉石仙桃乙醇提取物的還原能力與藥液濃度有關(guān)，藥液濃度越高，提取物的還原能力越強(qiáng)。藥液濃度為0.2 mg/mL時(shí)吸光度為0.19，濃度為0.5和0.8 mg/mL時(shí)吸光度為0.29和0.42，濃度增加至1.2 mg/mL時(shí)吸光度增大到0.54和0.63。濃度為2.0 mg/mL時(shí)吸光度達(dá)到了0.72，表明石仙桃乙醇提取物具有很好的還原能力。

圖3 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物的還原能力

3.3 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物的總酚含量測(cè)定結(jié)果

通過(guò)總酚含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)葉石仙桃乙醇提取物的總酚含量為39.7 mg/g，具有較高的總酚含量。結(jié)果表明，細(xì)葉石仙桃乙醇提取物優(yōu)良的ABTS·+自由基的清除能力和還原能力可能與其高含量酚類物質(zhì)有關(guān)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)冷浸法得到細(xì)葉石仙桃乙醇提取物，采用ABTS和還原能力體系來(lái)評(píng)估其抗氧化能力，并測(cè)定其總酚含量，探索細(xì)葉石仙桃乙醇提取物總酚含量和其抗氧化能力之間的關(guān)系。結(jié)果表明，細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)ABTS自由基表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，在濃度為2.0 mg/ml時(shí)清除率為98.9%。該清除率與細(xì)葉石仙桃乙醇提取物的濃度和作用時(shí)間有關(guān)，濃度越大，作用時(shí)間越長(zhǎng)，則提取物對(duì)ABTS自由基提取物對(duì)ABTS自由基的清除率越高。細(xì)葉石仙桃乙醇提取物具有較高的總酚含量，表明其良好的抗氧化能力可能與其高含量酚類物質(zhì)有關(guān)。