劉可嘉王浩月李弘杰廖松潔余劍

大腦皮層局灶性梗死后，丘腦等遠(yuǎn)隔部位可發(fā)生繼發(fā)性損害，與腦卒中后認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)功能恢復(fù)不良等密切相關(guān)[1-3]。這種遠(yuǎn)隔損害機(jī)制尚未完全闡明，一般認(rèn)為包括炎性反應(yīng)在內(nèi)的多種因素參與其中[4]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，腦梗死后數(shù)日至數(shù)月，遠(yuǎn)隔丘腦部位可繼發(fā)膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎性介質(zhì)釋放，促使細(xì)胞凋亡和組織破壞，但結(jié)果并不完全一致[5-8]，仍缺乏對腦梗死后早期眾多炎性因素動態(tài)變化的研究，而在早期根據(jù)不同炎性因素的變化進(jìn)行適時調(diào)控將有可能成為臨床潛在的治療策略之一。本研究中，我們選用腎血管性高血壓大鼠建立局灶性皮層梗死模型[9]，較全面地觀察皮層梗死后早期階段同側(cè)丘腦膠質(zhì)細(xì)胞激活與炎性介質(zhì)釋放的動態(tài)變化，探討遠(yuǎn)隔損害早期可能的干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對象從廣東省醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心購進(jìn)70～100 g雄性SD大鼠，復(fù)制易卒中型腎血管性高血壓模型（stroke-prone renovascular hypertensive rat，RHRSP）[9]。 12 周后選取尾動脈壓高于 180 mmHg且無自發(fā)卒中的大鼠以電凝法[10]行右側(cè)大腦中動脈皮層支閉塞術(shù) （middle cerebral artery occlusion,MCAO）。假手術(shù)和MCAO組在術(shù)后1、4、8 d取材，每組9只，共54只。改良神經(jīng)功能缺損 評 分 （modified neurological severity scores，mNSS）[11]用于評價神經(jīng)功能，分值越高表明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.2 腦組織處理3%戊巴比妥麻醉，每組6只經(jīng)升主動脈灌注冰生理鹽水沖凈血液后開顱，在冰上分取出同側(cè)丘腦，置液氮中速凍后再于-80℃冰箱保存；另3只用4%多聚甲醛灌注固定后完整取出腦組織，再后固定8 h，經(jīng)蔗糖溶液脫水，用OCT包埋，制成冰凍切片，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色冰凍切片復(fù)溫水化，先蘇木素染色，再用鹽酸乙醇分化、自來水返藍(lán)，之后伊紅染色，經(jīng)酒精梯度脫水、二甲苯透明后，用封片膠封片，鏡下觀察拍照。

1.4 免疫熒光檢測膠質(zhì)細(xì)胞活化、炎性介質(zhì)表達(dá)與神經(jīng)元數(shù)目冰凍切片經(jīng)復(fù)溫水化后，高溫修復(fù)，封閉，滴加一抗，分別是炎性介質(zhì)白細(xì)胞介素6（IL-6，1∶100，Abcam， 兔源）、 腫瘤壞死因子 α（TNF-α，1∶100，Affinity，兔源）和細(xì)胞粘附分子（ICAM-1，1∶100，Proteintech，兔源），星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物 GFAP（1∶300，Atlas，小鼠源），小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物 Iba-1（1∶400，Wako，兔源）以及神經(jīng)元標(biāo)記物 NeuN （1∶500，Abcam， 小鼠源）。 濕盒 4℃過夜，再選用Alexa Fluor 555山羊抗兔、Alexa Fluor 488或 594山羊抗小鼠二抗 （1∶500，Cell signaling Technology），室溫避光1 h后封片，熒光顯微鏡下觀察拍攝，統(tǒng)計GFAP、Iba-1及NeuN的數(shù)目。

1.5 Western blot檢測炎性介質(zhì)表達(dá)取出冰凍保存的丘腦，稱重后用含PMSF的RIPA裂解液裂解，BCA試劑盒測定蛋白濃度，無菌水稀釋配平濃度，煮沸變性。行SDS-PAGE垂直電泳，每孔30μg，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉1 h，加兔源性一抗 IL-6（1∶800，Abcam）、TNF-α（1∶500,Affinity）、ICAM-1（1∶1000，Proteintech）、β-actin（1∶1000，Cell signaling Technology），4℃搖床過夜后予HRP偶聯(lián)的山羊抗兔二抗，室溫?fù)u床1 h，用ECL發(fā)光液（Millipore）顯像。使用Image-J軟件進(jìn)行灰度值測定。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析用SPSS 20對數(shù)據(jù)行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計，采用單因素方差分析（ANOVA）比較多組間均數(shù)，用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)、上下四分位數(shù)M（QL，QU）表示，并采用K-W檢驗(yàn)比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分假手術(shù)組和MCAO組的mNSS評分在術(shù)前均為0分。在術(shù)后1、4、8 d，假手術(shù)組均保持0分無變化，而MCAO組評分在各時間點(diǎn)均明顯增加（χ2=26.818，P＜0.001），以術(shù)后 1 d[8.0（7.5， 9.0）分]最高，之后緩慢下降，術(shù)后 8 d[7.0（5.5， 7.0）分]時分值仍較高。

2.2 皮層梗死灶HE染色顯示，假手術(shù)組腦冠狀切面完整，未見梗死灶（圖1，A），而MCAO 4 d組可見右側(cè)皮層梗死灶，與未梗死區(qū)脫離（圖1，B），而丘腦、中腦等遠(yuǎn)隔部位未見異常。

圖1 HE染色示腦冠狀面圖像。A：假手術(shù)組；B：MCAO 4 d組。示梗死灶位于右側(cè)大腦皮層（*）。標(biāo)尺2 mm

2.3 膠質(zhì)細(xì)胞活化、炎性因子表達(dá)與神經(jīng)元數(shù)目變化免疫熒光（圖2、表1）顯示，與假手術(shù)組相比，MCAO術(shù)后1 d，GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞和Iba-1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞呈輕度活化，表現(xiàn)為胞體稍變大，但數(shù)量尚無明顯差異；而在MCAO術(shù)后 4 d和 8 d，星形膠質(zhì)細(xì)胞 （F=77.01，P＜0.001）和小膠質(zhì)細(xì)胞（F=26.09，P＜0.001）均出現(xiàn)明顯活化，表現(xiàn)為胞體變大，突起變粗，數(shù)量明顯增多。 免疫熒光（圖 3）和 western blot（圖 4、表 2）共同提示炎性介質(zhì)的表達(dá)：與假手術(shù)組相比，MCAO術(shù)后 ICAM-1（F=8.07，P＜0.001）、IL-6（F=9.90，P＜0.001）、TNF-α（F=9.52，P＜0.001）均有顯著變化。通過兩兩比較，發(fā)現(xiàn)術(shù)后1 d僅ICAM-1表達(dá)增多，IL-6和TNF-α無明顯改變；至術(shù)后4 d，三者表達(dá)均增多；術(shù)后8 d，ICAM-1和TNF-α仍維持高水平，而IL-6則回復(fù)至低水平。通過對NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元進(jìn)行計數(shù)，發(fā)現(xiàn)MCAO術(shù)后1 d神經(jīng)元數(shù)目無明顯改變，術(shù)后4 d，數(shù)目雖有減少，但尚無統(tǒng)計學(xué)意義，在術(shù)后8 d則明顯減少 （F=7.45，P＜0.05）（圖 5、表 1）。

表1 GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞、Iba-1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞和NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)目變化

圖2假手術(shù)及MCAO后各時間點(diǎn)同側(cè)丘腦GFAP和Iba-1的免疫熒光示意圖。200倍，標(biāo)尺50 μm。

圖3免疫熒光示假手術(shù)及MCAO后各時間點(diǎn)同側(cè)丘腦ICAM-1、IL-6、TNF-α 的表達(dá)。200倍，標(biāo)尺50 μm。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在易卒中型腎血管性高血壓大鼠大腦皮層局灶性梗死后早期 （術(shù)后1～8 d），在伴神經(jīng)功能缺損的同時，同側(cè)丘腦出現(xiàn)繼發(fā)的炎性反應(yīng)，但炎性細(xì)胞激活和炎性介質(zhì)釋放并不一致。星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞從術(shù)后1 d起即激活并持續(xù)至術(shù)后8 d；而術(shù)后1 d炎性介質(zhì)僅ICAM-1增多，術(shù)后4 d時IL-6和TNF-α開始增多，至8 d時，IL-6表達(dá)顯著減弱回到初始水平，而ICAM-1和TNF-α仍維持高水平，此時，伴有同側(cè)丘腦神經(jīng)元數(shù)目的顯著減少，神經(jīng)功能缺損恢復(fù)緩慢，表明遠(yuǎn)隔丘腦的差異性炎性反應(yīng)可能影響神經(jīng)元存活與神經(jīng)功能恢復(fù)。

表2假手術(shù)及MCAO后各時間點(diǎn)同側(cè)丘腦炎性介質(zhì)蛋白表達(dá)水平

圖4 Western blot示假手術(shù)及MCAO后各時間點(diǎn)同側(cè)丘腦ICAM-1、IL-6、TNF-α 的表達(dá)。

圖5假手術(shù)及MCAO后各時間點(diǎn)同側(cè)丘腦NeuN的表達(dá)。200倍，標(biāo)尺 50 μm

既往對腦梗死后遠(yuǎn)隔損害的研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)隔部位可出現(xiàn)炎性反應(yīng)，并與神經(jīng)細(xì)胞減少存在時間相關(guān)性，但因所使用動物模型和觀察時間不同，結(jié)果并不一致，且缺乏對腦梗死后早期遠(yuǎn)隔部位眾多炎性因素動態(tài)變化的研究[6，7]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了遠(yuǎn)隔丘腦在腦梗死后早期即可繼發(fā)膠質(zhì)細(xì)胞激活，且其出現(xiàn)早于神經(jīng)元損害，提示對于遠(yuǎn)隔部位繼發(fā)的炎性反應(yīng)需及早進(jìn)行干預(yù)，以減輕遠(yuǎn)隔神經(jīng)元損傷和改善神經(jīng)功能。

目前對免疫炎性機(jī)制在腦卒中后病理生理反應(yīng)中的作用仍有爭議。盡管在動物實(shí)驗(yàn)中顯示有效，但多種針對免疫細(xì)胞和炎性介質(zhì)的抗炎治療并未在腦卒中的臨床實(shí)驗(yàn)中顯示出明顯有益的效果[12]。炎性介質(zhì)種類眾多、在不同類型腦卒中后的表達(dá)部位、濃度、時間和活化信號等均不盡相同，只是單一地調(diào)控某種炎性介質(zhì)結(jié)局往往不能盡如人意[12]，因此，我們推測，對多種炎性介質(zhì)的變化進(jìn)行動態(tài)觀察并進(jìn)行針對性干預(yù)是有意義的。本研究觀察了3種代表性的炎性介質(zhì)ICAM-1、IL-6和TNF-α在腦梗死后遠(yuǎn)隔丘腦早期的動態(tài)變化。ICAM-1是一種細(xì)胞間粘附分子，而IL-6和TNF-α則是強(qiáng)效的促炎因子[13]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三者雖然都有不同程度增高，但變化趨勢不同，ICAM-1增高更快速（術(shù)后1 d），可能是早期介導(dǎo)炎性發(fā)展的重要因子；而IL-6先高（術(shù)后4 d）后低（術(shù)后8 d），提示其作用具有短效性；TNF-α則在術(shù)后4 d表達(dá)增多，并持續(xù)至8 d。三種炎性因子中，ICAM-1和IL-6在同側(cè)丘腦的表達(dá)尚無報道，而LOOS M等[6]報道TNF-α在術(shù)后1 d上調(diào)，3 d時降低，與本研究存在差異，差異可能與模型有關(guān)。LOOS M等采用的是正常血壓大鼠，而本研究所采用的是RHRSP模型，能更好地模擬臨床并能提高造模成功率[14]。

本研究對大鼠皮層梗死后早期遠(yuǎn)隔丘腦繼發(fā)的炎性反應(yīng)進(jìn)行了動態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)不同炎性介質(zhì)的釋放具有差異性，且早于神經(jīng)元損傷，這為今后對其進(jìn)行多靶點(diǎn)的精準(zhǔn)調(diào)控提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，為減輕遠(yuǎn)隔損害提供了一種可行的治療方法。