孫波 鄒甜 王志偉 吳琪 楊紅波 王興輝 孫小武

摘 要： 利用SSR分子標記技術對‘雪龍三號西瓜品種及其親本間的多態(tài)性進行了引物篩選和種子純度研究。結果表明，在供選的23對SSR核心引物中，有2對引物（BVWS02048和BVWS00106）在‘雪龍三號雜交種及其親本的帶型具有多態(tài)性。利用這2對引物對‘雪龍三號進行純度鑒定，鑒定結果均為98%，與大田純度檢測結果吻合率達99%，說明SSR分子標記對‘雪龍三號的純度鑒定結果是可靠的。同時2對引物鑒定結果的一致也驗證了品種的真實性。

關鍵詞： 西瓜； DNA提取； SSR標記； 純度鑒定

Abstract： In the study， SSR markers were used to screen polymorphic primers between ‘Xuelong No. 3 watermelon cultivar and their parents， and to identify seed purity of ‘Xuelong No. 3. Results showed that the two （BVWS02048 and BVWS00106） of 23 core SSR primers has be more polymorphic at ‘Xuelong No. 3 hybrids and their parents. Subsequently， the two pairs of primers were used to determine the purity of ‘Xuelong No. 3， and their purification results were 98%， which was up to 99% prediction matches morphological analysis. These results indicated that a purity identification of ‘Xuelong No. 3 using SSR molecular markers is viable. Simultaneously， the uniform results of these two pairs of primers also verified the authenticity of cultivar.

Key words： Watermelon；DNA extraction；SSR markers；Identification of purity

據(jù)統(tǒng)計，2016年我國西瓜播種面積189.08萬hm2，總產(chǎn)量7 940萬t[1]，在部分地區(qū)西瓜產(chǎn)業(yè)已成為主導產(chǎn)業(yè)。生產(chǎn)上因“假種子”造成損失的現(xiàn)象層出不窮，品種的純度與種子質量密切相關。由于傳統(tǒng)的純度鑒定多以形態(tài)標記為主，其檢測周期長且結果易受環(huán)境影響。分子標記鑒定可以大幅提升檢測效率，而且鑒定過程由于減少了外界因素干擾，其結果也更加準確。

利用分子標記技術鑒定西瓜品種純度的技術已較為成熟。趙勝杰等[2]利用SRAP技術對生產(chǎn)上主推的9個無籽西瓜品種進行了雜交種純度鑒定；王鳴剛等[3]認為只要反應條件適合、引物選擇正確，RAPD技術完全適用于西瓜雜交種的純度鑒定；而閆鵬等[4]通過對100條RAPD引物的篩選，未能篩到在Tx14E及其親本間具有多態(tài)性的RAPD標記；李菊芬等[5]比較了RAPD、ISSR、SSR 3種方法在西瓜雜交種及其親本間的多態(tài)性，僅在供試的SSR引物里找到了特異引物，這說明SSR分子標記技術相對于其他分子標記技術具有一定的優(yōu)越性，在其他農(nóng)作物如水稻[6]、小麥[7]、玉米[8]、油菜[9]純度鑒定中均有廣泛應用。李超汗等[10]從28對SSR核心引物里篩出了5對特異引物，可對5個西瓜品種進行純度鑒定。隨著西瓜全基因組的測序完成，隨之開發(fā)出的SSR核心引物極大地加快了該技術在西瓜種子純度鑒定方面的進程。

‘雪龍三號西瓜品種是湖南地區(qū)主栽品種，耐重茬，高抗枯萎病，筆者旨在通過對23對SSR核心引物的篩選，對該品種的純度進行快速、準確的鑒定，以縮短檢測周期、保障瓜農(nóng)利益。同時為核心SSR標記在西瓜純度鑒定方面的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

‘雪龍三號及其親本由湖南省瓜類研究所提供。以‘雪龍三號及其親本為材料進行引物篩選。DNA提取試劑盒及PCR擴增試劑均購于天根生物公司，引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 引物篩選階段DNA提取方法 取‘雪龍三號種子10粒，親本種子各5粒，將種子用55 ℃熱水浸種3 h，放入恒溫培養(yǎng)箱32 ℃催芽，待種芽長到約3 cm長的時候，取下種芽混合放入圓底EP管，加入石英砂用玻棒用力研磨至種芽在管內呈乳白色粉末狀，然后按照DNA提取試劑盒進行操作。

1.2.2 純度鑒定階段DNA提取方法 取100?！埲柗N子放入圓底EP管，加入石英砂，利用高通量自動研磨器進行研磨，研磨充分后（每次研磨時間3 min，研磨2～3次）按照DNA提取試劑盒進行操作。

1.2.3 DNA質量及濃度檢測 通過微量核酸蛋白分析儀測定。

1.2.4 SSR-PCR反應體系及擴增程序 引物來源：參照國家蔬菜工程中心許勇團隊發(fā)表的23對西瓜SSR核心引物，核心引物位點覆蓋全基因組且均勻分布于西瓜的染色體上[11]（表1）。反應總體系為20 μL，其中Taq Buffer 2 μL（Mg2+為15 mmol·L-1），2.5 mmol·L-1的dNTPS加1.6 μL，Taq酶為1 U，10 μmol·L-1上下游引物各1 μL，DNA為50 ng。擴增程序為94 ℃預變性4 min，94 ℃變性20 s，55 ℃復性20 s，72 ℃延伸90 s，35次循環(huán)，72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。PCR產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上進行電泳（電泳緩沖液為0.5×TBE），電泳完畢在凝膠成像儀上觀察。

1.2.5 特異引物條件的優(yōu)化 對擴增效果不理想的特異引物，通過擴大凝膠濃度，減小電泳時的電壓以及延長電泳時間來進行優(yōu)化。

1.2.6 SSR分子標記的純度鑒定結果與大田純度鑒定結果的比較 田間純度結果由科研人員于2017年9—11月在海南省樂東縣利國鎮(zhèn)紅五村種植，通過觀察株形、坐瓜節(jié)位、果型等形態(tài)指標檢測得到。在邵陽市農(nóng)業(yè)科學研究院生物技術中心利用SSR特異引物對同一批次的種子進行純度鑒定。室內檢測純度結果與大田檢測純度結果吻合率=室內結果/田間結果。

2 結果與分析

2.1 SSR特異引物的篩選

利用23對引物在‘雪龍三號及其親本間進行擴增，有2對引物在親本及F1之間具有多態(tài)性（圖1），分別為BVWS02048和BVWS00106。其中BVWS02048可以看出F1和親本有差異，但特異條帶不明顯。BVWS00106在F1擴出的條帶一條來自父本，一條來自母本，為典型的雙親互補型條帶，且條帶較為清晰無雜帶，特異位點位于5號染色體上，可用于‘雪龍三號的純度鑒定。

2.2 特異引物條件的優(yōu)化

BVWS02048由于特征帶未完全分開，采用擴大凝膠濃度，降低電壓，延長電泳時間的方法來進行電泳。將瓊脂糖凝膠的濃度增加到4%，電泳時電壓由100 V降低到70 V，電泳時間延長至120 min。電泳結果如圖2，可以看出，F(xiàn)1的特征帶較為明顯，特異位點在10號染色體上。一般品種不純主要由母本自交引起，因此只要引物擴出的條帶在母本與F1之間有差異就可以用來做純度鑒定，所以BVWS02048也可用來檢測‘雪龍三號的純度。

2.3 ‘雪龍三號純度的鑒定

2.3.1 田間純度鑒定 科研人員播種150粒，成苗145棵，在果實成熟期通過觀察株型、坐瓜節(jié)位、果型等形態(tài)指標，判斷有2株為母本自交株，純度為98.6%。

2.3.2 SSR分子標記純度鑒定 取與田間純度鑒定同一批次的‘雪龍三號種子200粒，平均分成2份，分別用BVWS02048、BVWS00106來進行純度鑒定。利用BVWS02048對‘雪龍三號進行純度鑒定的部分電泳圖如圖3，有2粒種子擴出的條帶與F1有差異，由于BVWS02048擴出的父本和母本條帶之間差異較小，因此無法確定2粒假種子是父本混雜還是母本混雜，一般而言，除開機械混雜的可能性，母本混雜是品種不純的主要原因，即BVWS02048進行純度鑒定的結果為98%。利用BVWS00106進行純度鑒定的部分電泳圖如圖4，可以看出有2粒種子擴出的條帶與母本相同，為母本自交株，BVWS00106純度鑒定結果也為98%。2對特異引物鑒定結果與大田鑒定結果吻合率98%/98.6%≈99%，且2對引物鑒定結果的一致也說明了品種的真實性。

3 討論與結論

在種子生產(chǎn)過程中，種子不純主要是因為母本去雄不徹底自交而產(chǎn)生的假雜種，所以一般純度鑒定只需要找到在母本與F1代有多態(tài)性的引物即可。但由于外源花粉的飛入或者人工造成的不同品種間的機械混雜，則需要利用多對特異引物的組合來進行鑒定，即構建多重PCR體系，以保證品種真實性，提高準確率。目前利用多重PCR對品種進行鑒定在其他作物上已有應用，常宏等[12]通過對玉米SSR核心引物進行重新分析與設計，建立了21對SSR通用引物構成的8組多重PCR體系，大大提高了檢測效率，為多重PCR技術在玉米上的應用奠定了堅實的基礎。陳浩東等[13]利用了最多四重SSR-PCR對棉花品種進行了純度鑒定，并且對多重PCR的程序進行了優(yōu)化。多重PCR在西瓜品種鑒定方面的應用鮮有報道，僅劉子記等[14]曾建立了雙重PCR體系鑒定了小西瓜‘美月的純度。筆者則是通過對2對特異引物鑒定結果的比較來保證品種的真實性，并未將特異引物進行組合。在西瓜品種純度的研究里，大多數(shù)研究人員確定品種真實性的方法與筆者類似，但此方法略顯繁瑣，隨著SSR核心引物的開發(fā)，對核心引物進行組合，盡快的建立SSR核心引物的多重PCR，將會極大地促進西瓜品種純度研究的發(fā)展。

筆者通過對23對SSR核心引物的篩選，2對引物在‘雪龍三號及其親本間具有多態(tài)性，在瓊脂糖凝膠電泳中，擴大凝膠濃度，降低電壓，延長電泳時間可以更好區(qū)分開長度相差較小的條帶。利用特異引物對‘雪龍三號進行純度鑒定的結果與大田鑒定結果吻合率達99%，充分說明SSR分子標記技術鑒定品種純度是可靠的。同時利用多對特異引物對品種進行純度檢測，既可以驗證品種的真實性，還能準確反映純度檢測結果。

參考文獻

[1] 屈冬玉.中國農(nóng)業(yè)統(tǒng)計資料（2016）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2016：57.

[2] 趙勝杰，劉文革，閻志紅，等.基于SRAP的三倍體無子西瓜品種指紋分析和雜種純度鑒定[J].果樹學報，2009，26（5）：687-691.

[3] 王鳴剛，謝放，郭小玲.利用RAPD方法鑒定西瓜雜種純度的研究[J]. 廈門大學學報，2003，42（1）：112-116.

[4] 閆鵬，張建農(nóng)，陳雨.西瓜和甜瓜雜種一代種子純度的RAPD鑒定[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2007，42（2）：43-46.

[5] 李菊芬，許玲，馬國斌.利用分子標記技術鑒定西瓜雜交種純度[J].上海農(nóng)業(yè)學報，2009，25（1）：72-75.

[6] 周會.利用分子生物學技術鑒定農(nóng)作物品種真實性和純度[D].成都：四川農(nóng)業(yè)大學，2012.

[7] 趙偉.雜交小麥種子純度鑒定技術的研究與利用[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2007.

[8] 蔡甫格，陳紅艷，張秀偉，等.安單3號玉米雜交種純度SSR檢測與田間鑒定的比較[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2013，41（10）：35-37.

[9] 李保軍，王灝，王愛娜，等.應用SSR鑒定化學殺雄雜交油菜秦雜油19種子純度的研究[J].分子植物育種，2013，11（4）：517-524.

[10] 李超漢，劉莉，劉翔.基于SSR標記的5個西瓜新品種純度鑒定及特異性分析的研究[J].中國農(nóng)學通報，2015（33）：177-185.

[11] ZHANG HAIYING，WANG HUI，GUO SHAOGUI，et al.Identification and validation of a core set of microsatellite markers for genetic diversity analysis in watermelon，Citrullus lanatus Thunb. Matsum. & Nakai[J].Euphytica，2012，186（2）：329-342.

[12] 常宏，王漢寧，張金文，等.玉米品種真實性和純度鑒定的SSR標記多重PCR體系優(yōu)化[J].草業(yè)學報，2010，19（2）： 204-211.

[13] 陳浩東，劉方，王為，等.棉花多重PCR技術及其對雜交棉純度鑒定的初步研究[J].棉花學報，2011，23（1）：22-27.

[14] 劉子記，詹園鳳，朱婕.利用 SSR 標記鑒定西瓜雜交種純度的研究[J].熱帶作物學報，2016，37（9）：1714-1718.