胡國艷，楊 欣，徐 鵬，許 瑩，林裕龍，羅新妮，鐘笑梅

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科;b.藥學(xué)部，廣東 廣州510000；2.廣州市惠愛醫(yī)院(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院)a.檢驗(yàn)科;b.神經(jīng)內(nèi)科)

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是新近發(fā)現(xiàn)的一類共價(jià)鍵閉合環(huán)狀RNA分子。盡管早在1970年RNA病毒中就發(fā)現(xiàn)circRNA的存在[1,2]，但隨后的30年僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)幾個(gè)環(huán)狀RNA，因其表達(dá)水平低被認(rèn)為只是特定表達(dá)或RNA異常剪接的產(chǎn)物，并未受到重視，研究進(jìn)展緩慢。隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，人們?cè)谡婧思?xì)胞發(fā)現(xiàn)了大量circRNA[3]，且某些circRNA可以發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA的作用來調(diào)控基因表達(dá)，還可以作為miRNA海綿來影響基因的調(diào)控和表達(dá)[4-6]。circRNA由于形成閉合的環(huán)狀，在生物體內(nèi)非常的穩(wěn)定[4,7]，因此，其有可能成為一種良好的生物標(biāo)志物。

阿爾茨海默病(AD)是伴有常染色體缺陷和神經(jīng)元喪失的神經(jīng)退行性病變，發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為γ-分泌酶是導(dǎo)致AD的關(guān)鍵因素之一[8]，γ-分泌酶是由四個(gè)膜整合蛋白組成的包含19次跨膜螺旋的復(fù)合體，包括PS1、Aph-1、Pen-2和Nicastrin四個(gè)亞基，主要參與β-淀粉樣蛋白前體(APP)和Notch等重要跨膜蛋白的切割和水解過程，其中早老素基因PSEN1(Presenilin 1,PS1)是執(zhí)行酶活性功能的膜整合蛋白酶活性亞基，為該酶的催化亞單位[9-12]。

前期研究表明circRNA大多是由外顯子參與環(huán)化[6]；我們推測PS1也有可能存在circRNA。對(duì)PS1基因的全長RNA 序列進(jìn)行分析，PS1(基因登錄號(hào)NM_000021.3)mRNA 由12個(gè)外顯子組成；本研究針對(duì)12個(gè)外顯子分別設(shè)計(jì)反向PCR引物，來擴(kuò)增可能存在的circRNA；通過這種方法，我們?cè)谌松窠?jīng)母細(xì)胞瘤SY5Y細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)了由PS1 mRNA的第2、3、4、5外顯子環(huán)化而成的circRNA，此circRNA全長序列為615個(gè)核苷酸，我們將其命名為Cir-PS1-615。并建立了Cir-PS1-615的檢測方法，對(duì)AD患者與對(duì)照組血液進(jìn)行了檢測。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑ABI7500 實(shí)時(shí)熒光PCR儀(Life公司)，PMD18-TA克隆載體(TAKARA公司)，TRIzol○RReagent(Life公司)，Nucleic Acid Stain 核酸染料(北京鼎國昌盛)，NormalRunTM250 bp-II DNA ladder(上海捷瑞)，全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(上海培清)，HiScript○RII 1st Strand cDNA 合成試劑盒(Vazyme)，AceQ○RqPCR SYBR○RGreen Master Mix(Vazyme)。

1.2研究對(duì)象研究對(duì)象經(jīng)1名神經(jīng)科副高或以上醫(yī)師及1名精神科副高或以上醫(yī)師診斷一致方納入研究。AD組：從本院神經(jīng)內(nèi)科、老年精神科住院的AD患者收集共30例，其中男16例，女14例，年齡60-90歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)簡易精神狀態(tài)檢查(Mini Mental State Examination，MMSE)評(píng)分文盲≤ 17分，小學(xué)文化≤ 20分，初中及以上文化≤24分。(2)符合DSM-Ⅳ癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)。(3)符合美國神經(jīng)病學(xué)、語言障礙和中風(fēng)研究所及阿爾茨海默病與相關(guān)障礙協(xié)會(huì)(NINCDS-ADRDA)1984年修訂的“很可能AD”的診斷標(biāo)準(zhǔn)。(4)無甲狀腺功能低下、葉酸缺乏、維生素B12缺乏、物質(zhì)濫用和感染等其它原因?qū)е碌陌V呆病史。(5)頭顱MRI檢查排除血管性癡呆及腫瘤、腦積水等其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的癡呆。正常對(duì)照(Normal Control，NC)組：從社區(qū)老人中招募，共30例，年齡50-74歲，其中男15例，女15例。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)無認(rèn)知障礙主訴。(2)無神經(jīng)或精神疾病史，無癡呆家族史。(3)MMSE評(píng)分文盲>17分，小學(xué)文化>20分，初中及以上文化>24分。(4)CDR=0分。(5)頭顱MRI檢查無明顯異常。入組者均簽署了知情同意書，并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)SH-SY5Y(ATCC Number:CRL-2266)細(xì)胞于含10%胎牛血清(GIBCO)DMEM培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4TA克隆和測序根據(jù)PS1基因的RNA(登錄號(hào)：NM_000021.3)序列設(shè)計(jì)12對(duì)反向PCR擴(kuò)增引物，引物序列參見表1，提取SH-SY5Y細(xì)胞的總RNA ，然后用random 逆轉(zhuǎn)錄引物合成 cDNA，反向PCR擴(kuò)增PS1的外顯子序列，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物克隆到PMD18-TA克隆載體中，然后DNA測序鑒定。

表1 PCR引物序列

1.5RT-qPCR對(duì)入組患者抽取EDTA-K2抗凝血，按試劑說明書提取標(biāo)本總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后對(duì)樣本進(jìn)行Cir-PS1-615檢測，同時(shí)檢測PS1mRNA，每個(gè)樣本重復(fù)檢測3次。內(nèi)參為actin，引物序列及產(chǎn)物見表2。反應(yīng)體系為10 μl ，AceQ○RqPCR SYBR○RGreen Master Mix 5 μl，F(xiàn)orward primer (10 μM) 0.2 μl，Reverse primer (10 μM) 0.2 μl，50x ROX Reference Dye 2 0.2 μl，模板DNA 2 μl，滅菌蒸餾水加至10 μl。反應(yīng)條件為95℃ 5 min預(yù)變性；95℃ 10sec，60℃ 34sec，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光；再加入熔解曲線：95℃ 15sec，60℃ 60sec，95℃ 15sec。根據(jù)2-△△C t公式計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)情況。

表2 PS1 circRNA-615 and mRNA PCR檢測引物序列

2 結(jié)果

2.1TA克隆和測序結(jié)果分別針對(duì)PS1基因12個(gè)外顯子設(shè)計(jì)反向PCR擴(kuò)增引物(圖1A)，擴(kuò)增結(jié)果顯示PS1基因的 第2,3,4,5有明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增大小約600 bp(圖1B)；將PCR產(chǎn)物連接到TA克隆載體上進(jìn)行DNA序列測定，比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)PS1基因的第2和第5外顯子首尾連接環(huán)化(圖1C、D)，PS1基因參與形成PS1-circRNA的長度為615 bp，將此circRNA命名為Cir-PS1-615 (圖1E)。

(A) Construction Chart of PS1 mRNA (Accession No.NM_000021),design of RT-PCR primers for each exon;(B) Agarose electrophoretogram for PCR products,significant amplification product is found in Electrophoresis Channel 2-5.M:Marker DL2000;(C) Results of TA cloning and sequencing for PCR product,with the arrow indicating connected sites for PS1 cyclization;(D,E) PS1 Exon 2-5 involved in the cyclization to generate circRNA-PS1,among which,Exon2:82 bp,Exon3:140 bp,Exon4:251 bp,Exon5:142 bp.circRNA-PS1 consists of 615 nucleotides.

2.2Cir-PS1-615在AD中的表達(dá)特異性檢測Cir-PS1-615，上游引物跨越環(huán)化位點(diǎn)，擴(kuò)增大小176 bp(圖2A)；線性 PS1 mRNA的檢測引物擴(kuò)增大小111 bp(圖2B)；通過對(duì)臨床AD患者的血液標(biāo)本進(jìn)行PT-QPCR基因表達(dá)檢測，結(jié)果顯示Cir-PS1-615 在AD患者中表達(dá)量普遍下降(n=30，P<0.05)(圖2C)；線性的 PS1 mRNA 在AD 患者中表達(dá)量升高(圖2D)；Cir-PS1-615和線性的 RNA 比例成負(fù)相關(guān)。

(A) PCR primer testing PS1 circular RNA,spanning cyclization binding sites,amplified size of 176 bp；(B) PCR primers testing PS1 linear RNA,spanning exons 8 and 9,amplified size of 111 bp；(C,D) RT-QPCR detection of expression differences between PS1 circular RNA and linear RNA in the AD patients and control groups.

3 討論

我們的結(jié)果顯示人PS1基因客觀存在一種環(huán)狀RNA，且在AD患者中Cir-PS1-615表達(dá)明顯降低，和線性的PS1 mRNA表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。本研究樣本量有限，還需要進(jìn)行大樣本的驗(yàn)證。在本文發(fā)出時(shí)，我們查閱到circBase里已經(jīng)有了PS1環(huán)狀RNA的資料，也有一個(gè)615 bp的環(huán)狀RNA，經(jīng)比對(duì)，正是我們檢測到的Cir-PS1-615。

目前對(duì)于circRNA的具體功能尚未明確，只有幾種假定的說法：1) circRNA可以作為“sponge”海綿吸附miRNA ，抑制其功能[13]；2) circRNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)直接調(diào)控其他RNA水平[5]；3) circRNA能與蛋白質(zhì)結(jié)合,抑制蛋白質(zhì)活性、募集蛋白質(zhì)復(fù)合體的組分或調(diào)控蛋白質(zhì)的活性[14]；4) circRNA也可作為翻譯的模板指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成[15,16]。對(duì)于PS1 蛋白的生物學(xué)功能研究比較多，有大量文章報(bào)道PS1基因的突變與AD密切關(guān)聯(lián)[17-19]，PS1作為 γ-分泌酶的重要組分參與APP的代謝途徑，還參與Notch通路和Wnt信號(hào)通路等[20-23]，那么Cir-PS1-615是否和AD疾病有關(guān)聯(lián)？ Cir-PS1-615在AD疾病和對(duì)照中有表達(dá)性差異，我們推測Cir-PS1-615在AD疾病發(fā)生發(fā)展過程中有重要的生物學(xué)功能。Cir-PS1-615發(fā)揮生物學(xué)功能是通過哪一種方式？為什么其表達(dá)量和線性的PS1 mRNA 呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)？這是我們以后要解決的問題。目前對(duì)于Cir-PS1-615產(chǎn)生環(huán)化的具體機(jī)制還不清楚，最近有研究報(bào)道RNA結(jié)合蛋白QKI能特異性結(jié)合基因的內(nèi)含子中，促進(jìn)circRNA的產(chǎn)生，在EMT過程中circRNA可能扮演重要角色[24]；雖然通過高通量測序結(jié)合生物信息學(xué)分析提示在生物體內(nèi)客觀存在大量circRNA，但是大部分circRNA的功能還是未知。人們開展circRNA的生物學(xué)功能及其在人類疾病發(fā)生、發(fā)展中作用的研究才剛剛起步，因此對(duì)于circRNA有待我們更多的探索。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)了AD密切關(guān)聯(lián)基因PS1的一種RNA環(huán)化現(xiàn)象，此circRNA的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步明確PS1基因的生理學(xué)功能打下基礎(chǔ)。circRNA由于其形成封閉的環(huán)狀，在細(xì)胞內(nèi)外可以很穩(wěn)定的存在，且可以在血液循環(huán)中流動(dòng)，我們通過臨床AD患者的血液標(biāo)本PT-QPCR檢測發(fā)現(xiàn)，Cir-PS1-615 在AD中表達(dá)明顯降低，因此Cir-PS1-615有可能成為更加理想的檢測阿爾茨海默的早期臨床診斷指標(biāo)。對(duì)Cir-PS1-615生理學(xué)功能的研究，可以為以后開發(fā)預(yù)防治療阿爾茨海默的靶點(diǎn)藥物打下基礎(chǔ)。