袁素素，秦武灑，張瑋瑋，王財成，葉秀娟

(福建農(nóng)林大學,福建 福州 350002)

傳統(tǒng)化學農(nóng)藥的長期使用，對地球環(huán)境和人體健康都造成了極大的危害，從天然產(chǎn)物中尋找新的抗菌藥物成為解決這一難題的途徑之一，近年來抗菌蛋白在農(nóng)業(yè)上的潛在應用價值越來越被人們關注[1]?？咕鞍资巧矬w在長期進化過程中為了抵御病菌的侵害而產(chǎn)生的，目前，在很多植物、動物、真菌和細菌中都發(fā)現(xiàn)抗菌蛋白的存在[2-3]。Chan等[4]從褐色蕓豆中分離出一種分子質量約為5.4 ku的抗菌蛋白，能夠有效抑制落花生球腔菌的生長；Ye等[5]從紅色甘藍中純化出一種分子質量約為30 ku的蛋白質，也對落花生球腔菌有抑制活性；Wang等[6]從地衣芽孢桿菌中分離出一種抗菌蛋白，其分子質量約為55 ku，能夠抑制黃瓜霜霉病菌的生長，在葉片噴灑這種抗菌蛋白，能夠有效抑制致病菌的侵染。抗真菌蛋白按其結構或功能可分為以下幾類：幾丁質酶、類幾丁質酶蛋白、幾丁質結合蛋白、類親環(huán)素蛋白、脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、防衛(wèi)素、類防衛(wèi)素、葡聚糖酶、凝集素、脂轉移蛋白、過氧化物酶、蛋白酶抑制劑、核糖體失活蛋白等[7]。

紫菜薹(BrassicacampestrisL.var.purpureaBaileysh)是十字花科蕓薹屬植物，別名紅菜薹、紅油菜薹等。紫菜薹在蔬菜生產(chǎn)和消費中占有重要地位，在長江中下游流域和華南地區(qū)種植較多，是湖北省冬春季的主要特產(chǎn)蔬菜。紫菜薹莖和葉的色素中富含花色苷類物質，具有抗氧化、抗突變、抗癌、抗炎癥及抗病毒等多種生物活性[8-10]，目前關于紫菜薹的研究主要集中在栽培、分子遺傳以及生態(tài)學方面[11-13]，而對其種子中抗菌蛋白的研究報道較少。為此，以紫菜薹種子為研究對象，純化抗菌蛋白并對其抑菌活性和穩(wěn)定性進行初步研究，旨在純化出抗菌效果較好的抗菌蛋白，進而開發(fā)為替代化學農(nóng)藥的一種抗菌藥物，為解決傳統(tǒng)農(nóng)藥在長期使用中產(chǎn)生的問題提供一種方法。

1 材料和方法

1.1 供試材料

茄病鐮刀菌(Fusariumsolanif)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、煙草炭疽病菌(Colletotrichummicotianae)、芭樂炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、落花生球腔菌(Mycosphaerellaarachidicola)、蘋果黑腐皮殼菌(Valsamali)、凸臍蠕孢菌(Exserohilummonoceras)和灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)共9種供試植物病原真菌，均由福建農(nóng)林大學生物農(nóng)藥與生物化學教育部重點實驗室提供。

紫菜薹種子購買于湖北省武漢市九頭鳥種業(yè)有限責任公司。

1.2 紫菜薹種子抗菌蛋白的純化

稱取250 g干凈的紫菜薹種子，用1 L 10 mmol/L NH4OAc緩沖溶液(pH值4.5)浸泡，置于4 ℃冰箱24 h，用豆?jié){機磨成勻漿，8 000 r/min離心20 min，取上清液依次按以下步驟純化紫菜薹種子抗菌蛋白。

用10 mmol/L NH4OAc緩沖溶液(pH值4.5)平衡SP-Sepharose陽離子交換層析柱(5 cm×20 cm)，將上述上清液進行上樣，上樣結束后，繼續(xù)用10 mmol/L NH4OAc緩沖溶液(pH值4.5)對未吸附的蛋白質進行洗滌，至280 nm吸光度值(OD280 nm)為0。然后分別用含有0.2、0.5、1.0 mol/L NaCl的10 mmol/L NH4OAc緩沖溶液(pH值4.5)洗脫，在280 nm下檢測吸光度，同時依次進行吸收峰收集。以芭樂炭疽病菌為指示菌，運用紙片擴散法對各個洗脫組分進行抑菌活性檢測，將具有活性的組分用蒸餾水透析，冷凍干燥得活性蛋白干粉。

用10 mmol/L NH4OAc緩沖液(pH值4.5)平衡Mono STM5/50GL強陽離子交換層析柱，流速為1 mL/min，將上一步的活性蛋白干粉溶解在相同的緩沖液中(質量濃度不超過50 mg/mL)，上樣量為1 mL，上樣結束后，繼續(xù)用10 mmol/L NH4OAc緩沖液(pH值4.5)對未吸附的蛋白質進行洗滌，至OD280 nm為0。然后采用0～1 mol/L的鹽梯度對吸附蛋白進行洗脫，同時進行吸收峰收集，以芭樂炭疽病菌為指示菌，運用紙片擴散法對各個峰收集組分進行抑菌活性檢測，將具有活性的組分用蒸餾水透析，冷凍干燥得到活性蛋白干粉。

用20 mmol/L NH4HCO3緩沖液(pH值9.2)平衡SuperdexTM75 10/300GL層析柱，流速為0.5 mL/min，將上一步的活性蛋白干粉溶解在相同的緩沖液中(質量濃度不超過5 mg/mL)，上樣量為100 μL，上樣結束后，繼續(xù)用20 mmol/L NH4HCO3緩沖液(pH值9.2)洗脫，同時對吸收峰進行收集。以芭樂炭疽病菌為指示菌，運用紙片擴散法對各個峰收集組分進行抑菌活性檢測，將具有活性的組分用蒸餾水透析，冷凍干燥得到活性蛋白干粉樣品，即為紫菜薹種子抗菌蛋白樣品。

1.3 抗菌蛋白的抑菌活性檢測

運用紙片擴散法[3]，將植物病原真菌預先接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)至菌落直徑為3 cm時，將已經(jīng)滅菌的濾紙片(直徑6 mm)放置在距離菌落邊緣0.5 cm處，用移液槍在濾紙片上加待測樣品溶液15 μL，繼續(xù)培養(yǎng)，直至出現(xiàn)半月形，觀察并記錄抑菌結果。

1.4 抗菌蛋白的SDS-PAGE分析

運用SDS-PAGE電泳進行分析，依次配制15%分離膠、4%濃縮膠，按預定的次序加入標準蛋白質(Marker)和紫菜薹種子抗菌蛋白樣品，開始用30 V恒壓電泳，待蛋白質條帶進入分離膠時，增加電壓至80 V，待蛋白質條帶距離分離膠底部1 cm時關閉電源。取出電泳凝膠，進行考馬斯亮藍染色，2～3 h后用含10%冰乙酸(V/V)和10%甲醇(V/V)的脫色液進行脫色。

1.5 抗菌蛋白的穩(wěn)定性檢測

1.5.1 pH值穩(wěn)定性 分別配制pH值為1、2、3、11、12、13的PBS緩沖液，同時用PBS緩沖液(pH值7.4)配制1 mg/mL的抗菌蛋白樣品溶液。取6個離心管，在每個離心管中加入50 μL抗菌蛋白樣品溶液，冷凍干燥后，分別向離心管中加入上述不同pH值的PBS緩沖液50 μL，靜置30 min。以PBS緩沖液(pH值7.4)為陰性對照，以未處理的抗菌蛋白樣品溶液為陽性對照(CK)，用芭樂炭疽病菌作為指示菌，通過紙片擴散法檢測抗菌蛋白樣品溶液的抑菌活性。

1.5.2 熱穩(wěn)定性 用PBS緩沖液(pH值7.4)配制1 mg/mL的抗菌蛋白樣品溶液，取5個離心管各加入50 μL抗菌蛋白樣品溶液，分別在40、50、60、70、80 ℃處理30 min后，用紙片擴散法，以芭樂炭疽病菌為指示菌檢測抗菌蛋白樣品溶液的抑菌活性。

1.5.3 金屬陽離子穩(wěn)定性 用無菌水配制濃度為100 mmol/L的Al3+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、K+、Cr3+溶液，用PBS緩沖液(pH值7.4)配制1 mg/mL的抗菌蛋白樣品溶液。取50 μL抗菌蛋白樣品溶液分裝在11個離心管中，冷凍干燥后，分別向離心管中加入50 μL上述離子溶液和無菌水，其中加入無菌水為對照組(CK)，室溫放置1 h，以芭樂炭疽病菌為指示菌，用紙片擴散法檢測抗菌蛋白樣品溶液的抑菌活性。

1.5.4 表面活性劑穩(wěn)定性 用無菌水配制200 mmol/L的SDS溶液和2%(V/V)的吐溫(Tween 80)溶液，用PBS緩沖液(pH值7.4)配制1 mg/mL的抗菌蛋白樣品溶液。取3個1.5 mL的離心管，以體積比1∶1分別加入抗菌蛋白樣品溶液和表面活性劑溶液(或無菌水)，其中加入無菌水為對照組(CK)，室溫放置1 h，以芭樂炭疽病菌為指示菌，用紙片擴散法檢測抗菌蛋白樣品溶液的抑菌活性。

1.5.5 有機溶劑穩(wěn)定性 分別配制20%(V/V)的甲醇、乙醇、丙醇、丙三醇、丙酮溶液，用PBS緩沖液(pH值7.4)配制1 mg/mL的抗菌蛋白樣品溶液。取5個1.5 mL的離心管，以體積比1∶1分別加入上述有機溶劑和抗菌蛋白樣品溶液，另取1個離心管，以體積比1∶1加入抗菌蛋白樣品溶液和無菌水為對照(CK)，室溫放置1 h，以芭樂炭疽病菌為指示菌，用紙片擴散法檢測抗菌蛋白樣品溶液的抑菌活性。

2 結果與分析

2.1 紫菜薹種子抗菌蛋白的純化結果

將紫菜薹種子上清液上樣于SP-Sepharose陽離子交換層析柱，對吸附蛋白進行鹽梯度洗脫，得到SP1、SP2、SP3共3個吸收峰組分(圖1A)，抑菌活性檢測發(fā)現(xiàn)，SP2吸收峰組分對芭樂炭疽病菌具有抑制活性(圖2)。

圖1 紫菜薹種子抗菌蛋白的純化結果

將SP2吸收峰組分上樣于Mono STM5/50GL強陽離子交換柱，得到MS1和MS2共2個吸收峰組分(圖1B)，抑菌活性檢測發(fā)現(xiàn)，MS1吸收峰組分對芭樂炭疽病菌有抑菌活性(圖2)。將MS1吸收峰組分上樣于SuperdexTM75 10/300GL層析柱，得到SUP1、SUP2、SUP3共3個吸收峰組分(圖1C)，抑菌活性檢測發(fā)現(xiàn)，SUP2吸收峰組分對芭樂炭疽病菌具有抑制活性(圖2)。對SUP2吸收峰組分進行SDS-PAGE電泳分析(圖1D)，結果表明，從紫菜薹種子分離的抗菌蛋白為單一條帶，分子質量約為13 ku，與十字花科植物山葵葉片中WjAMP-1抗菌蛋白的分子質量(15 ku)大小相近[14]。蘿卜種子抗菌蛋白(9 ku)[15]和油菜種子campesin抗菌蛋白(9.4 ku)[16]比紫菜薹種子抗菌蛋白的分子質量稍小。Lin等[17]從菜薹中純化出分子質量為5.7 ku的brassiparin抗菌蛋白，分子質量遠小于紫菜薹種子抗菌蛋白，因而二者不是同一種抗菌蛋白。

圖2 柱層析各吸收峰組分的抑菌活性測定結果

2.2 紫菜薹種子抗菌蛋白的抑菌活性測定結果

用紙片擴散法檢測紫菜薹種子抗菌蛋白對植物病原真菌的抑制活性，結果顯示，紫菜薹種子抗菌蛋白對茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、煙草炭疽病菌、芭樂炭疽病菌、稻瘟病菌、落花生球腔菌、蘋果黑腐皮殼菌、灰葡萄孢菌共8種植物病原真菌的生長具有抑制活性(圖3)，而對凸臍蠕孢菌的生長沒有抑制活性，說明紫菜薹種子抗菌蛋白的抗菌譜比較廣。在十字花科其他植物中也純化出具有廣譜抗菌活性的抗菌蛋白，如蘿卜種子Rs-AFP1和Rs-AFP2抗菌蛋白[18]、油菜種子campesin抗菌蛋白[16]和山葵葉片WjAMP-1抗菌蛋白[14]。

CK：PBS緩沖溶液；1：落花生球腔菌；2：蘋果黑腐皮殼菌；3：稻瘟病菌；4：芭樂炭疽病菌；5：灰葡萄孢菌；6：尖孢鐮刀菌；7：煙草炭疽病菌；8：茄病鐮刀菌圖3 紫菜薹種子抗菌蛋白的抑菌活性測定結果

2.3 紫菜薹種子抗菌蛋白的pH值穩(wěn)定性與熱穩(wěn)定性

紫菜薹種子抗菌蛋白溶液經(jīng)過不同pH值條件處理，用于檢測抗菌蛋白的pH值穩(wěn)定性，結果表明，其在pH值1～3和11～13條件下處理后，仍對芭樂炭疽病菌具有較強的抑制活性(圖4A)，說明紫菜薹種子抗菌蛋白在強酸強堿環(huán)境下穩(wěn)定性較好；紫菜薹種子抗菌蛋白樣品溶液經(jīng)過不同溫度條件處理，用于檢測抗菌蛋白的熱穩(wěn)定性，結果表明，其在40、50、60、70、80 ℃條件下處理后，對芭樂炭疽病菌仍然具有較強的抑制活性(圖4B)，說明紫菜薹種子抗菌蛋白的熱穩(wěn)定性較好。已有其他研究發(fā)現(xiàn)，油菜抗菌蛋白和芥藍種子抗菌蛋白也具有熱穩(wěn)定性和強酸強堿穩(wěn)定性[16-17,19]。

圖4 紫菜薹種子抗菌蛋白的pH值穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性試驗結果

2.4 紫菜薹種子抗菌蛋白的金屬陽離子穩(wěn)定性

紫菜薹種子抗菌蛋白經(jīng)過不同金屬陽離子處理后，用于檢測抗菌蛋白的金屬陽離子穩(wěn)定性(表1)。抗菌蛋白在100 mmol/L的金屬陽離子條件下，Al3+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+、Mg2+、K+、Cr3+8種金屬離子對其抑菌活性沒有明顯影響，而Ca2+、Mn2+處理后，抗菌蛋白的抑菌活性消失，由此可知，紫菜薹種子抗菌蛋白經(jīng)過大部分金屬陽離子處理后，仍然對芭樂炭疽病菌具有抑制活性，因而紫菜薹種子抗菌蛋白的金屬陽離子穩(wěn)定性較好。蘿卜種子抗菌蛋白Rs-AFP1和Rs-AFP2在50 mmol/L的K+條件下，抑菌活性也保持穩(wěn)定[18]，而山葵葉片WjAMP-1抗菌蛋白在Ca2+、K+、Mg2+存在時，抑菌活性銳減[14]，由此可知，不同的抗菌蛋白對金屬離子的耐受性不同。

表1 紫菜薹種子抗菌蛋白的金屬陽離子穩(wěn)定性試驗結果

注：+為有抑菌活性，-為無抑菌活性，下同。

2.5 紫菜薹種子抗菌蛋白的表面活性劑穩(wěn)定性

紫菜薹種子抗菌蛋白經(jīng)過表面活性劑SDS(200 mmol/L)和吐溫(2%)處理后，抑菌活性測定結果如圖5所示，可知抗菌蛋白仍然對芭樂炭疽病菌具有抑制活性，說明表面活性劑對紫菜薹種子抗菌蛋白的抑菌活性沒有影響。

圖5 紫菜薹種子抗菌蛋白的表面活性劑穩(wěn)定性試驗結果

2.6 紫菜薹種子抗菌蛋白的有機溶劑穩(wěn)定性

紫菜薹種子抗菌蛋白經(jīng)甲醇、乙醇、丙醇、丙三醇、丙酮處理，用于檢測抗菌蛋白對有機溶劑的穩(wěn)定性，結果如表2，可以看出，紫菜薹種子抗菌蛋白對甲醇、乙醇、丙醇、丙三醇、丙酮5種有機溶劑穩(wěn)定。

表2 紫菜薹種子抗菌蛋白的有機溶劑穩(wěn)定性試驗結果

3 結論與討論

在十字花科植物中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種抗菌蛋白的存在，如油菜[16,19-20]、山葵[14]、芥藍[21]、蘿卜[18]、大白菜[22]、擬南芥[23]、花菜[24]等中的抗菌蛋白，但對紫菜薹種子抗菌蛋白的研究還較少。本試驗選取紫菜薹種子作為研究材料，勻漿后將其上清液依次通過SP-Sepharose陽離子交換層析柱、Mono STM5/50GL強陽離子交換層析柱和SuperdexTM75 10/300GL層析柱，分離得到一種天然的抗菌蛋白，采用SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，紫菜薹種子抗菌蛋白分子質量約為13 ku，屬于小分子質量的抗菌蛋白，與山葵WjAMP-1抗菌蛋白分子質量(15 ku)相近[14]。然后對該抗菌蛋白的抑菌活性進行初步檢測，發(fā)現(xiàn)其對8種植物病原真菌具有抑制活性，是一種廣譜抗菌蛋白。

為研究紫菜薹種子抗菌蛋白的潛在應用價值，進而測定了該抗菌蛋白的pH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、金屬陽離子穩(wěn)定性、表面活性劑穩(wěn)定性和有機溶劑穩(wěn)定性。結果表明，紫菜薹種子抗菌蛋白能夠耐強酸強堿和高溫環(huán)境，除Mn2+、Ca2+以外的大多數(shù)金屬離子不影響紫菜薹種子抗菌蛋白的抑菌活性。此外，表面活性劑和有機溶劑對紫菜薹種子抗菌蛋白的抑菌活性也都無影響。因而可知，紫菜薹種子抗菌蛋白是一種抑菌活性穩(wěn)定、不易受環(huán)境影響、具有潛在應用價值的抗菌蛋白。

十字花科植物抗菌蛋白對病原真菌具有較強的抑制活性。其中，紅色甘藍抗菌蛋白分子質量約為30 ku，對落花生球腔菌的半抑制濃度(IC50)為5 μmol/L[5]；芥藍種子抗菌蛋白分子質量為5.9 ku，對尖孢鐮刀菌、玉米小斑病菌、落花生球腔菌、蘋果樹腐爛病菌的IC50分別為4.3、2.1、2.4、0.15 μmol/L[21]。結合本研究發(fā)現(xiàn)的抗菌蛋白的熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性、金屬離子穩(wěn)定性等生物學活性，可知十字花科植物抗菌蛋白具有開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛在應用價值。為了更好地開發(fā)紫菜薹種子的應用價值，還需要對紫菜薹種子抗菌蛋白的抑菌效果和機制展開進一步研究。