陳寧美，歐陽(yáng)舒毓，徐維烈，唐 帥，韋善君，馮金朝，徐小靜*

(1.中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081；2.武漢合緣綠色生物股份有限公司，湖北 武漢 430070)

鎘(cadmium，Cd)是一種非生物必需的重金屬元素，也是重要的環(huán)境污染物之一，會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害，并在食物鏈中富集[1]。受到鎘脅迫時(shí)，植株生長(zhǎng)發(fā)育和生理代謝均會(huì)受到影響[2-6]。土壤中的鎘接觸根部后通過(guò)共質(zhì)體和質(zhì)外體2個(gè)途徑穿過(guò)皮層進(jìn)入木質(zhì)部。為抵御鎘的毒害，植物會(huì)產(chǎn)生一系列生理生化機(jī)制限制其吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，如位于內(nèi)皮層的凱氏帶阻隔鎘進(jìn)入木質(zhì)部[7-8]。木栓質(zhì)是構(gòu)成凱氏帶的主要組成之一，分布于內(nèi)皮層細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，具有較強(qiáng)的離子屏障作用[9]。木栓質(zhì)組成成分包括未被取代脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、α,ω-二羧酸、脂肪醇、甘油、酚類等物質(zhì)，是一種植物次生代謝產(chǎn)物，屬于脂類-酚類多聚物，沉積于植物特定邊界組織細(xì)胞壁上，如根內(nèi)皮層、根及塊莖周皮、種子皮[10]。

木栓質(zhì)代謝包括木栓質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、組裝和調(diào)控4個(gè)方面[10]。參與木栓質(zhì)單體合成的酶包括細(xì)胞色素P450單加氧酶(CYP)[11]、β-酮酯酰-CoA合成酶 (KCS)[12]、脂肪酰還原酶(FAR)[13]、甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)[14]、阿魏酰轉(zhuǎn)移酶 (ASFT/AtHHT)[15]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如ABCG1，ABCG2，ABCG5，ABCG6、ABCG20[16-18]參與木栓質(zhì)形成。在木栓質(zhì)形成中，轉(zhuǎn)錄因子起重要的調(diào)節(jié)作用，如AtMYB9、AtMYB107轉(zhuǎn)錄調(diào)控脂肪族和芳香單體的生物合成、運(yùn)輸、木栓質(zhì)聚合[18]。

鹽芥(Thellungiellasalsuginea)屬于十字花科植物，是研究植物耐鹽分子機(jī)制的模式植物[19]。研究發(fā)現(xiàn)，鹽芥除了能夠耐受高鹽環(huán)境外，也能夠耐受低溫[20]、干旱[21]及一定濃度的重金屬鉛[22]等逆境環(huán)境。賈文娟[23]研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫下，鹽芥地上部分和根中大量積累脯氨酸，保護(hù)細(xì)胞膜和酶的結(jié)構(gòu)，同時(shí)葉片中的抗壞血酸、谷胱甘肽、過(guò)氧化物酶含量顯著增加，以緩解鎘脅迫對(duì)鹽芥的傷害。2012年，通過(guò)第二代測(cè)序技術(shù)獲得了鹽芥全基因組序列信息，為鹽芥抗逆分子機(jī)制的揭示提供了極大便利[24]。本研究以鹽芥為材料，對(duì)不同濃度鎘脅迫下根木栓質(zhì)組成、含量及相關(guān)基因表達(dá)模式變化進(jìn)行分析，以探究鹽芥根木栓質(zhì)對(duì)重金屬鎘脅迫的響應(yīng)，為培育鎘耐受植物提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)所用種子為山東型鹽芥種子，為中央民族大學(xué)植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。鹽芥種子先4 ℃春化處理7 d，然后均勻播種在蛭石與營(yíng)養(yǎng)土等比混合的花盆里。光照/黑暗處理時(shí)間為12 h/12 h，光照強(qiáng)度6 000 lx，溫度22 ℃，空氣濕度30%～60%。2周后移栽，在上述培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)。鹽芥生長(zhǎng)6周后，將長(zhǎng)勢(shì)良好、大小均一的植株平均分成3組，1組為正常生長(zhǎng)的對(duì)照組(CK)，其他2組分別用50 μmol/L、100 μmol/L CdAc2溶液處理。將鎘脅迫處理24 h的鹽芥根用于基因表達(dá)分析，每5株為1個(gè)平行，每組選3個(gè)平行。將鎘脅迫處理1周的鹽芥根用于木栓質(zhì)測(cè)定，每5株為1個(gè)平行，每組選5個(gè)平行。

1.2 鹽芥根木栓質(zhì)組分及含量測(cè)定

鹽芥根木栓質(zhì)的提取包括脫脂、解聚、衍生化等過(guò)程。鹽芥根的脫脂參照Li-Beisson等[25]的方法進(jìn)行：在盛有干燥后的脫脂樣品試管中加入25 μL C17: 0 ME標(biāo)準(zhǔn)品(1 mg/mL)作為內(nèi)標(biāo)(用以后續(xù)定量計(jì)算)；然后依次加入0.9 mL乙酸甲酯、1.5 mL甲醇鈉、3.6 mL甲醇；將試管60 ℃金屬浴2 h；冷卻后，分別加入10 mL二氯甲烷、10 mL冰醋酸，將混合液pH值調(diào)整為4～5；再加入6 mL 0.5 mol/L的NaCl溶液，充分振蕩；搖勻后2 000 r/min離心5 min；將有機(jī)相取出轉(zhuǎn)移至新試管中；向新試管中加入0.5 mol/L NaCl溶液，充分振蕩洗滌，搖勻后2 000 r/min離心10 min(該洗滌步驟重復(fù)2次)；將上層液體棄掉，加入6 g無(wú)水硫酸鈉后充分振蕩(將有機(jī)相中殘余水分吸收)，2 000 r/min離心5 min；將液體轉(zhuǎn)移至反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，用氮?dú)獯蹈桑謩e加入100 μL吡啶、100 μL乙酸酐，60 ℃金屬浴2 h；冷卻后，用氮?dú)獯蹈梢后w，用甲苯-庚烷(體積比為1∶1)混合液重新溶解反應(yīng)產(chǎn)物，轉(zhuǎn)移至上樣瓶用于GC(Gas Chromatography)檢測(cè)。

GC氣相色譜儀設(shè)置的程序條件為：進(jìn)樣量為1 μL；分流比設(shè)置為1∶10；進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度均設(shè)定為320 ℃；柱箱初始溫度為80 ℃，先以15 ℃/min升溫至200 ℃，再以1.5 ℃/min升溫至230 ℃，接著以5 ℃/min升溫至300 ℃。氣相色譜柱使用的是30 m×0.25 mm HP-5MS毛細(xì)管柱，氮?dú)庾鳛檩d氣。

1.3 鹽芥根總RNA提取及mRNA逆轉(zhuǎn)錄

鹽芥根總RNA提取、cDNA制備分別使用北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的EasyPure?Plant RNA Kit、TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒。具體操作詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索已報(bào)道的擬南芥木栓質(zhì)代謝相關(guān)基因cDNA，并利用獲得的基因序列搜索鹽芥木栓質(zhì)代謝相關(guān)基因的cDNA或ESTs。運(yùn)用Primer 3對(duì)所得的cDNA或ESTs序列設(shè)計(jì)引物。管家基因UBQ5作為內(nèi)參基因，其上、下游引物分別為TsAtUBQ5 P1(CAACCCTAACGGGGAAGAC)、TsAtUBQ5 P2 (CCCGTCTTCTTCTTCCTCTTC)。熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)40次。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系包括2×TransStart?Top Green qPCR SuperMix 5 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各 0.2 μL、ddH2O 3.6 μL，總體積為10 μL。試驗(yàn)使用Bio-Rad MyIQ2型熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)照組的基因表達(dá)量設(shè)定為1，處理組中的基因表達(dá)量用2-△△CT表示[26]，計(jì)算不同鎘濃度處理下基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 錄入數(shù)據(jù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Origin和Excel進(jìn)行制圖，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫對(duì)鹽芥根木栓質(zhì)組分及含量的影響

共檢測(cè)出4種類型的木栓質(zhì)，即未被取代脂肪酸、脂肪醇、ω-羥基脂肪酸、α,ω-二羧酸，共包括21種木栓質(zhì)單體，即C16∶0未被取代脂肪酸、C18∶0未被取代脂肪酸、C18∶2未被取代脂肪酸、C18∶3未被取代脂肪酸、C20∶0未被取代脂肪酸、C22∶0未被取代脂肪酸、C24∶0未被取代脂肪酸、C18∶0脂肪醇、C20∶0脂肪醇、C22∶0脂肪醇、16-OH C16∶0 ω-羥基脂肪酸、18-OH C18∶0 ω-羥基脂肪酸、18-OH C18∶1 ω-羥基脂肪酸、18-OH C18∶2 ω-羥基脂肪酸、20-OH C20∶0 ω-羥基脂肪酸、22-OH C22∶0 ω-羥基脂肪酸、24-OH C24∶0 ω-羥基脂肪酸、C18∶0 α,ω-二羧酸、C18∶1 α,ω-二羧酸、C20∶0 α,ω-二羧酸、C22∶0 α,ω-二羧酸。不同濃度鎘脅迫下鹽芥根木栓質(zhì)單體含量見(jiàn)圖1。C18∶2未被取代脂肪酸、C18∶3未被取代脂肪酸、C22∶0未被取代脂肪酸、16-OH C16∶0 ω-羥基脂肪酸、18-OH C18∶1 ω-羥基脂肪酸、C18∶1 α,ω-二羧酸為鹽芥根木栓質(zhì)的優(yōu)勢(shì)組分。進(jìn)行不同濃度鎘脅迫處理之后，優(yōu)勢(shì)組分并未發(fā)生變化。50 μmol/L鎘脅迫時(shí)，除了C16∶0未被取代脂肪酸、C18∶2未被取代脂肪酸、C18∶3未被取代脂肪酸、C24∶0未被取代脂肪酸、18-OH C18∶1 ω-羥基脂肪酸、C22∶0 α,ω-二羧酸的含量未發(fā)生顯著變化外，其他組分與CK相比均顯著或極顯著增加。其中，極顯著增加的木栓質(zhì)單體中，16-OH C16∶0 ω-羥基脂肪酸、C18∶1 α,ω-二羧酸、C22∶0未被取代脂肪酸分別較CK增加了28.77%、28.45%、26.69%。100 μmol/L鎘脅迫時(shí)，C18∶0未被取代脂肪酸極顯著增加，較CK增加了70.46%，C18∶0脂肪醇含量顯著增加，較CK增加了37.91%，C22∶0 α,ω-二羧酸含量顯著降低，較CK降低了30.07%，其他組分含量變化不顯著。

*、**分別表示0.05、0.01水平差異顯著、極顯著，下同

4種類型的木栓質(zhì)含量從高到低依次為ω-羥基脂肪酸、未被取代脂肪酸、α,ω-二羧酸、脂肪醇(圖2)。50 μmol/L鎘脅迫下，鹽芥根木栓質(zhì)總量顯著增加，較CK增加了15.32%；脂肪醇、α,ω-二羧酸含量極顯著增加，分別較CK增加了23.52%、27.82%；未被取代脂肪酸、ω-羥基脂肪酸的含量變化不明顯。在100 μmol/L鎘脅迫下，鹽芥根木栓質(zhì)總量略有上升(0.95%)，未被取代脂肪酸、脂肪醇、ω-羥基脂肪酸、α,ω-二羧酸的含量與CK相比，差異均不顯著。

圖2 不同濃度鎘脅迫下鹽芥根木栓質(zhì)單體類型及其含量

2.2 鎘脅迫對(duì)鹽芥根木栓質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

利用同源比對(duì)在NCBI網(wǎng)站中選擇了16個(gè)與根木栓質(zhì)相關(guān)的基因(CYP77A6、CYP86B1、CYP86A4、CYP86A7、FAR4、FAR5、KCR2、KCR20、ABCG2、ABCG6、ABCG20、GPAT5、GPAT6、FACT、ASFT、MYB107)進(jìn)行表達(dá)模式分析。不同濃度鎘脅迫下鹽芥根中木栓質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖3。50 μmol/L鎘脅迫下，16個(gè)木栓質(zhì)代謝相關(guān)基因中有15個(gè)基因出現(xiàn)顯著或極顯著上調(diào)表達(dá)。其中，顯著上調(diào)表達(dá)的基因有：CYP86B1、CYP86A7、FAR4、FAR5、KCR2、ABCG2、GPAT6、FACT、MYB107；極顯著上調(diào)表達(dá)的基因有：CYP86A4、KCR20、ABCG6、ABCG20、GPAT5、ASFT。100 μmol/L鎘脅迫下，8個(gè)木栓質(zhì)代謝相關(guān)基因出現(xiàn)顯著或極顯著上調(diào)表達(dá)，顯著上調(diào)表達(dá)的基因有：CYP77A6、CYP86A7、FACT；極顯著上調(diào)表達(dá)的基因有：CYP86A4、ABCG2、GPAT5、ASFT、MYB107?？傮w上，50 μmol/L鎘脅迫下基因表達(dá)上調(diào)的幅度超過(guò)100 μmol/L鎘脅迫下基因表達(dá)上調(diào)的幅度，有10個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量在50 μmol/L鎘脅迫下高于在100 μmol/L鎘脅迫下。相對(duì)表達(dá)量超過(guò)CK 5倍的基因在50 μmol/L鎘脅迫下共有6個(gè)，而在100 μmol/L鎘脅迫下只有3個(gè)。

圖3 不同濃度鎘脅迫下鹽芥根木栓質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，鎘脅迫下16個(gè)木栓質(zhì)代謝相關(guān)基因均上調(diào)表達(dá)。CYP77A6、CYP86B1、CYP86A4、CYP86A7均屬于細(xì)胞色素P450家族，能催化脂肪酸ω-羥基化而形成木栓質(zhì)單體[31]，在50 μmol/L鎘脅迫下，其中3個(gè)基因出現(xiàn)顯著或極顯著上調(diào)表達(dá)，與6個(gè)ω-羥基脂肪酸單體含量極顯著增加相對(duì)應(yīng)。脂肪酸延長(zhǎng)酶催化形成不同碳原子數(shù)的脂肪酸，本研究選擇的KCR2、KCR20為脂肪酸延長(zhǎng)酶(FAE)復(fù)合體的異源四聚體之一[25]，在50 μmol/L鎘脅迫下，出現(xiàn)顯著或極顯著上調(diào)表達(dá)，可促使鹽芥形成不同碳原子數(shù)的脂肪酸。木栓質(zhì)前體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后穿過(guò)質(zhì)膜，組裝形成木栓質(zhì)。木栓質(zhì)前體的運(yùn)輸需要借助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥abcg2、abcg6、abcg20 3個(gè)突變體的根和種子中木栓質(zhì)總含量減少，外表面形成扭曲的片層結(jié)構(gòu)，滲透性增加，說(shuō)明ABCG2、ABCG6和ABCG20在擬南芥木栓質(zhì)形成中起至關(guān)重要的作用[16]。本研究在50 μmol/L鎘脅迫下，ABCG2、ABCG6和ABCG20有較高的相對(duì)表達(dá)量，從側(cè)面印證3個(gè)基因?qū)δ舅ㄙ|(zhì)形成的貢獻(xiàn)。Lashbrooke等[17]研究發(fā)現(xiàn)MYB107調(diào)控十字花科植物木栓質(zhì)的沉積。本研究中，2個(gè)濃度鎘處理下MYB107均上調(diào)表達(dá)，因此，MYB107可能在調(diào)控鹽芥根木栓質(zhì)的形成中起重要作用。GPAT5參與擬南芥木栓質(zhì)中脂肪酸的積累，特別是ω-羥基化的C22∶0、C24∶0脂肪酸及二羧酸單體[14]。本研究中，GPAT5在2個(gè)濃度鎘脅迫下均極顯著上調(diào)表達(dá)，與木栓質(zhì)中部分脂肪酸單體含量的增加相一致。

本研究共檢測(cè)出21種木栓質(zhì)單體，在低濃度和高濃度鎘脅迫下，根木栓質(zhì)單體含量變化趨勢(shì)和相關(guān)基因的表達(dá)存在差異。在50 μmol/L鎘脅迫下，木栓質(zhì)總含量升高，而100 μmol/L鎘脅迫下，木栓質(zhì)總含量未發(fā)生明顯變化。對(duì)木栓質(zhì)代謝相關(guān)的16個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)其在2個(gè)濃度鎘脅迫下均上調(diào)表達(dá)。其中，50 μmol/L鎘脅迫下有15個(gè)基因顯著或極顯著上調(diào)表達(dá)，100 μmol/L鎘脅迫下有8個(gè)基因顯著或極顯著上調(diào)表達(dá)，表明低濃度鎘脅迫能誘導(dǎo)鹽芥根產(chǎn)生更多的木栓質(zhì)單體，因此可能形成更為致密的木栓質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而阻止鎘離子進(jìn)入體內(nèi)，而高濃度的鎘則表現(xiàn)出對(duì)鹽芥產(chǎn)生毒害的趨勢(shì)。