武榮花，于曉淅，王 升，楊 攀，郭風(fēng)民

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.鄭州市城市園林科學(xué)研究所，河南 鄭州 450051)

月季(RosahybridaL.)為薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)觀賞植物，具有花期長、花色鮮艷、品種豐富、株型多樣的特點(diǎn)，是國內(nèi)外重要的園林花卉，素有“花中皇后”的美稱。在園林綠化中，月季被廣泛栽植于庭院、廣場、道路綠地等[1-4]。

植物組織培養(yǎng)是植物無性繁殖的一種重要手段。1967年，Hill[5]在研究建立月季品種再生體系的試驗(yàn)中，成功用莖段作為外植體誘導(dǎo)出愈傷組織，在月季組培方面獲得重大突破。近年來，關(guān)于月季組織培養(yǎng)的研究陸續(xù)有報(bào)道。如錢蕾[6]研究發(fā)現(xiàn)豐花月季粉-A不定芽的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA，最適增殖培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA，最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+(0.05～0.1)mg/L NAA；陳蘭芬[7]對(duì)7個(gè)微型月季組織培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，最適外植體材料是半木質(zhì)化帶芽莖段，最適增殖培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L BA+0.02 mg/L NAA+0.02 mg/L GA，生根培養(yǎng)基為1/2 MS+1.5 mg/L IBA。孟清秀等[8]通過對(duì)比試驗(yàn)，篩選出了藤本月季橘紅火焰的適宜消毒方法及培養(yǎng)基配方。閆春霞[9]以藤本月季多特蒙德作為材料進(jìn)行的組培試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其適宜的誘導(dǎo)發(fā)芽培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA，增殖培養(yǎng)基為MS+1 mg/L KT+1 mg/L IBA，生根培養(yǎng)基為1/2 MS+ 0.5 mg/L IBA。但上述研究大多是以多年生月季材料為外植體，而對(duì)1年生月季組織培養(yǎng)研究的報(bào)道較少。鑒于此，本研究選擇了3種月季雜交組合的5個(gè)1年生F1代植株，將其帶芽莖段作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，比較5個(gè)F1代植株在啟動(dòng)培養(yǎng)基上的萌芽率，篩選其適宜的增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基，以期為今后的快繁試驗(yàn)和其他月季雜交后代的組織培養(yǎng)試驗(yàn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料的選擇、處理

試驗(yàn)材料采集于鄭州市城市園林科研所月季品種園，分別為阿托加×胭脂點(diǎn)玉的F1代AY02、AY03；胭脂點(diǎn)玉×魁松香的F1代YK01；春田×魁松香的F1代CK01、CK04。于2017年10月下旬，采集其健康的帶芽莖段作為組培外植體。將采集回的枝條剪掉葉片，保留0.5 cm的葉柄，放在流水下沖洗，同時(shí)用小毛刷輕輕刷洗，去除表面灰塵。將沖洗干凈的枝條浸泡在加入適量洗衣粉的水中15 min，并用磁力攪拌器不斷攪拌。然后將枝條剪成2 cm的小段，每個(gè)莖段上帶有1～2個(gè)飽滿但未萌發(fā)的側(cè)芽，剪好的莖段放在流水下沖洗1 h，用濾紙吸干表面水分，放置在超凈工作臺(tái)上備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 本次試驗(yàn)中所有培養(yǎng)基均含有蔗糖30 g/L、瓊脂8 g/L，pH值調(diào)節(jié)至5.8。配制好的培養(yǎng)基以及試驗(yàn)所使用的鑷子、小刀、培養(yǎng)皿、燒杯、無菌水等均使用高壓滅菌鍋在120 ℃條件下滅菌20 min。培養(yǎng)室光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照時(shí)間為10～12 h/d，溫度為(24 ± 1)℃。

1.2.2 啟動(dòng)培養(yǎng) 啟動(dòng)培養(yǎng)接種前進(jìn)行外植體消毒，對(duì)外植體消毒條件進(jìn)行了預(yù)試驗(yàn)，最終確定為：先將外植體浸潤在75%酒精中30 s，倒出酒精后再用2%的NaClO溶液消毒13～14 min，之后用無菌水沖洗5次。消毒過程中不斷攪拌。啟動(dòng)培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，再添加2 mg/L的6-BA、0.1 mg/L的NAA作為外源激素。每個(gè)材料20瓶，每瓶接種2株消毒過的外植體。接種后第3天開始，每隔1 d統(tǒng)計(jì)1次褐化情況及污染率。腋芽生長至1.5 cm時(shí)進(jìn)行增殖培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)期間統(tǒng)計(jì)外植體的萌芽率。萌芽率=(萌發(fā)外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%，統(tǒng)計(jì)時(shí)假設(shè)污染為零。

1.2.3 增殖培養(yǎng) 將在啟動(dòng)培養(yǎng)基上萌發(fā)的適宜大小的腋芽從基部切掉，與外植體分離，去掉老化的組織后即可接種到增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)使用的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的外源激素6-BA、NAA。其中6-BA的質(zhì)量濃度有2個(gè)水平，分別為1 mg/L、2 mg/L；NAA的質(zhì)量濃度有3個(gè)水平，分別為0.01 mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L，具體見表1。接種30 d后統(tǒng)計(jì)各品種的增殖系數(shù)(繼代次數(shù)為1)。增殖系數(shù)=(培養(yǎng)后總芽數(shù)/接種時(shí)總芽數(shù))×100%，統(tǒng)計(jì)時(shí)假設(shè)污染為零。

表1 增殖培養(yǎng)基外源激素質(zhì)量濃度

1.2.4 生根培養(yǎng) 增殖培養(yǎng)中生長強(qiáng)健、長度超過2 cm的叢生芽可以進(jìn)行生根培養(yǎng)。將叢生芽切分成單株的芽，接種到生根培養(yǎng)基上。生根培養(yǎng)基使用的基本培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基，使用的外源激素為NAA，設(shè)置4個(gè)質(zhì)量濃度水平，分別為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L。接種15 d后，每隔3 d觀察1次，統(tǒng)計(jì)組培苗的生根數(shù)量及生根率。生根率=(生根幼苗數(shù)/接種幼苗總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同材料外植體啟動(dòng)培養(yǎng)萌芽率

將消毒后的外植體接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，約1周后腋芽開始萌動(dòng)，發(fā)芽率見表2?？梢钥闯?，AY02的萌芽率最低，只有64.00%，其余4個(gè)F1代莖段外植體的萌芽率均達(dá)到了70%以上，其中YK01的萌芽率最高，為83.33%。

表2 不同材料外植體啟動(dòng)培養(yǎng)萌芽率 %

2.2 不同材料腋芽增殖培養(yǎng)的增殖系數(shù)

從表3可以看出，不同材料腋芽在不同增殖培養(yǎng)基上的增殖系數(shù)差異較為明顯。總體來看，6-BA質(zhì)量濃度為2 mg/L時(shí)，不同材料腋芽的增殖系數(shù)均高于6-BA質(zhì)量濃度為1 mg/L時(shí)的增殖系數(shù)。其中，AY02、CK01的整體增殖系數(shù)在6個(gè)處理中整體較高，而AY03的整體增殖系數(shù)在6種增殖培養(yǎng)基中均偏低。AY02在增殖培養(yǎng)基6中增殖系數(shù)最高；AY03、YK01、CK01在增殖培養(yǎng)基5中增殖系數(shù)最高；CK04在增殖培養(yǎng)基5和增殖培養(yǎng)基6中增殖系數(shù)相同，均為最高。

由此可知，本次試驗(yàn)中AY02的最適增殖培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，AY03、YK01、CK01的最適增殖培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，CK04的最適增殖培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA和MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。

表3 不同材料腋芽增殖培養(yǎng)的增殖系數(shù) %

注：同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.3 不同材料組培幼苗在生根培養(yǎng)基上的生根情況

由表4—5可知，AY02在NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時(shí)生根率最高，其他4個(gè)材料組培幼苗在NAA質(zhì)量濃度為0.2 mg/L時(shí)生根率最高；當(dāng)NAA質(zhì)量濃度超過0.2 mg/L時(shí)，5個(gè)材料組培幼苗的生根率均逐漸下降，平均生根數(shù)也逐漸降低。因此，在本次生根培養(yǎng)設(shè)置的NAA質(zhì)量濃度梯度中，AY02的最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L NAA，AY03、YK01、CK01、CK04的最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.2 mg/L NAA。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)以較常用的帶芽莖段作為外植體，萌發(fā)較快且長勢較好。

表4 不同質(zhì)量濃度NAA對(duì)不同材料組培幼苗

表5 不同質(zhì)量濃度NAA對(duì)不同材料組培苗

在預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用2% NaClO溶液滅菌10 min時(shí)，外植體的污染率偏高，接近50%。增加消毒時(shí)間至13 min時(shí)消毒效果較好，污染率在33%左右。而消毒時(shí)間大于14 min時(shí)，部分外植體會(huì)有褐化、死亡的情況，故外植體的消毒時(shí)間宜在13～14 min。F1代植株均為1年生苗，植株較低矮，離地面較近，枝條上灰塵較多，這可能是其表面微生物較多，造成組培污染率偏高的主要原因。

外植體在啟動(dòng)培養(yǎng)時(shí)均能正常萌芽。而此次試驗(yàn)由于外植體材料較少，啟動(dòng)培養(yǎng)并未設(shè)置激素質(zhì)量濃度梯度，5個(gè)月季F1代植株外植體的萌芽率均未超過90%，試驗(yàn)設(shè)置的啟動(dòng)培養(yǎng)基可能并非最佳條件。在后續(xù)的組培快繁試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)置不同質(zhì)量濃度的激素啟動(dòng)培養(yǎng)基，以找到月季F1代植株外植體萌芽效果最好的啟動(dòng)培養(yǎng)基。

與多年生的月季植株相比，本次試驗(yàn)作為外植體的月季F1代植株生長時(shí)間較短，植株較為幼嫩。故在本次增殖培養(yǎng)試驗(yàn)中，參考沈國正等[10]、邱文青等[11]的增殖培養(yǎng)基中的激素含量，培養(yǎng)基中設(shè)置的NAA質(zhì)量濃度較低。增殖培養(yǎng)基中的6-BA質(zhì)量濃度在2 mg/L時(shí)總體增殖系數(shù)較高。AY02的最適增殖培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；AY03、YK01、CK01的最適增殖培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA；CK04的最適增殖培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA和MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。在增殖培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，增殖出的月季F1代組培苗與相同培養(yǎng)基上的多年生月季組培苗相比長勢偏弱，同樣可能和月季雜交1年生幼苗植株生長時(shí)間不長、營養(yǎng)物質(zhì)積累較少有關(guān)。

生根培養(yǎng)是組織培養(yǎng)的重要一步，只有能正常生根的幼苗才能最終形成完整的植株。AY02的最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L NAA；AY03、YK01、CK01、CK04的最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.2 mg/L NAA。本次生根培養(yǎng)中，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度在0.1 mg/L或0.2 mg/L時(shí)，月季F1代的生根效果較好。而NAA質(zhì)量濃度>0.3 mg/L時(shí)，生根效果反而不好。可以看出，較低質(zhì)量濃度的NAA對(duì)月季生根有促進(jìn)作用，而NAA質(zhì)量濃度過高時(shí)反而會(huì)對(duì)月季生根產(chǎn)生抑制作用。