張響英，唐現(xiàn)文

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300； 2.南京農(nóng)業(yè)大學，江蘇 南京 210095)

應激反應是機體對外界環(huán)境中不利因素所做出的一種保護性應答。生物體在應激條件下(如高溫、炎癥、過氧化物、腫瘤壞死因子等)都會產(chǎn)生一系列普遍而保守的應答，激活細胞信號通路，誘導細胞基因表達譜的改變。熱應激反應的典型特征之一是熱休克蛋白(HSPs)表達增加[1]。HSPs是細胞核內(nèi)高度保守的熱休克基因編碼的產(chǎn)物，主要作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運及組裝等過程，能恢復或加速清除細胞內(nèi)已變性的蛋白質(zhì)而穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)，細胞產(chǎn)生熱耐受[2]。

谷氨酰胺是一種條件必需氨基酸，正常情況下機體內(nèi)的谷氨酰胺處于穩(wěn)態(tài)平衡，但在應激狀態(tài)下，機體處于高分解狀態(tài)，體內(nèi)谷氨酰胺快速耗竭，必須及時從外界攝取才能防止機體代謝的失衡。谷氨酰胺不僅具有營養(yǎng)作用，還是細胞快速生長和分化的主要燃料，能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成和分解，參與機體的免疫調(diào)節(jié)、緩解機體疲勞等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，安全無毒的谷氨酰胺還是一種有效的HSP70誘導劑，補充谷氨酰胺可明顯增強各種應激狀態(tài)下多種細胞或組織HSP70的表達[4]，應激時補充谷氨酰胺對緩解應激損傷及損傷后修復有重要的意義。鑒于此，本研究通過谷氨酰胺誘導奶牛乳腺上皮細胞表達HSP70，觀察其對高溫應激所致的乳腺細胞凋亡是否具有抑制作用，以期為緩解奶牛的高溫應激損傷研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)、Gln(Amresco公司)、MTT(Amresco公司)、DEPC(Sigma公司)、Trizol試劑(大連寶生物工程有限公司)、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(大連寶生物工程有限公司)、熒光定量PCR試劑(Zoonbio公司)、半胱天冬酶3(Caspase-3)試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司)，其他試劑均為分析純級別。

1.1.2 儀器 無菌操作臺(蘇州凈化設備廠)、CO2培養(yǎng)箱(Banstead Internatonal 公司)、FTC 2000熒光定量PCR儀(楓嶺國際有限公司)、酶聯(lián)免疫儀(芬蘭Ladsystem公司)、WFJ 7200型可見分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)、凝膠成像系統(tǒng)(上海天能有限公司)、流式細胞儀(貝克曼庫爾特公司)等。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

采用組織塊法培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞[5]，取對數(shù)生長期細胞，分為對照組(C)：37 ℃培養(yǎng)細胞24 h；谷氨酰胺組(G)：含8 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h；高溫組(T)：正常培養(yǎng)的細胞置于41 ℃處理1 h，37 ℃恢復培養(yǎng)6 h；谷氨酰胺+高溫處理組(G+T)：含8 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h，置于41 ℃處理1 h，37 ℃恢復培養(yǎng)0、6、12 h，分別收集各處理組細胞。

1.3 細胞存活率檢測

收集各組對數(shù)生長期細胞，加入MTT培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入DMSO，靜置30 min，在酶聯(lián)免疫儀490 nm處測定吸光值。細胞存活率=(試驗組OD均值/對照組OD均值)×100%。

1.4 奶牛乳腺上皮細胞凋亡檢測

采用Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡，統(tǒng)計細胞死亡率。細胞死亡率=細胞早期凋亡率+細胞晚期凋亡率/壞死率。

1.5 實時熒光定量PCR檢測Bcl-2和HSP70基因表達量

從GenBank獲得目的基因mRNA序列，運用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物，引物序列見表1。

表1 Bcl-2、HSP70和GAPDH基因的熒光定量PCR引物

用Trizol試劑盒提取總RNA，核酸定量分析儀檢測其純度和含量，反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。反應體系：SYBR MIX 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 2.0 μL，ROX Dye 2.5 μL，無菌去離子水補至25 μL。

反應條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸45 s，40個循環(huán)，反應結(jié)束儀器自動生成Ct值及熔解曲線圖。樣本基因的表達強度用其對應GAPDH基因的表達量進行校正，即△Ct=Ct(Bcl-2/HSP70)-Ct(GAPDH)，其相對表達量采用2-ΔΔCt法進行分析。

1.6 Caspase-3活性檢測

使用Caspase-3比色試劑盒，按照使用說明檢測Caspase-3的活性。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果以平均值±標準差表示，采用SPSS 17.0軟件中的One-Way ANOVA進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷氨酰胺對高溫應激奶牛乳腺上皮細胞存活率的影響

由圖1可知，與對照組相比，谷氨酰胺組細胞存活率下降11.76%(P>0.05)，高溫組下降48.13%(P<0.01)；與高溫組相比，谷氨酰胺+高溫處理組在熱恢復0、6、12 h細胞存活率分別提高63.13%(P<0.01)、32.45%(P<0.05)、52.18%(P<0.01)。提示，谷氨酰胺預處理可提高奶牛乳腺上皮細胞的熱耐受性，緩解熱應激反應。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫

2.2 谷氨酰胺對高溫應激奶牛乳腺上皮細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，谷氨酰胺組奶牛乳腺上皮細胞早期凋亡率和晚期凋亡/壞死率均無明顯變化(P>0.05)，高溫組則明顯增高(P<0.01)；與高溫組相比，谷氨酰胺+高溫處理組在熱恢復0、6、12 h早期凋亡率分別下降63.28%(P<0.05)、35.00%(P>0.05)、54.84%(P<0.05)，晚期凋亡/壞死率分別下降51.06%(P<0.05)、31.09%(P<0.05)、39.88(P<0.05)(表2)?？梢?，谷氨酰胺可抑制熱應激誘導的奶牛乳腺上皮細胞凋亡。

2.3 谷氨酰胺對高溫應激奶牛乳腺上皮細胞Bcl-2 mRNA表達的影響

實時熒光定量PCR檢測奶牛乳腺上皮細胞Bcl-2 mRNA表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，谷氨酰胺組Bcl-2 mRNA表達量提高111.51%(P<0.05)，高溫組Bcl-2 mRNA表達量降低74.82%(P<0.05)；與高溫組相比，谷氨酰胺組Bcl-2 mRNA表達量明顯增高，約為高溫組的8.4倍(P<0.01)，谷氨酰胺+高溫處理組在熱恢復0、6、12 h時Bcl-2 mRNA表達量分別提高3.23倍(P<0.05)、2.49倍(P<0.05)、1.89倍(P>0.05)(圖2)。

表2 谷氨酰胺對高溫應激奶牛乳腺上皮細胞凋亡的影響 %

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

圖2 谷氨酰胺對高溫應激奶牛乳腺上皮細胞Bcl-2

2.4 谷氨酰胺對高溫應激奶牛乳腺上皮細胞HSP70 mRNA表達的影響

如圖3所示，谷氨酰胺組、高溫組、谷氨酰胺+高溫處理組(0 h)、谷氨酰胺+高溫處理組(6 h)、谷氨酰胺+高溫處理組(12 h)奶牛乳腺上皮細胞HSP70 mRNA表達量分別為對照組的5.91倍、6.78倍、8.28倍、11.12倍、9.18倍，差異極顯著(P<0.01)；與高溫組相比，谷氨酰胺組差異不顯著，谷氨酰胺+高溫處理組在熱恢復6 h時HSP70 mRNA表達量進一步增高(P<0.05)。

2.5 谷氨酰胺對高溫應激奶牛乳腺上皮細胞Caspase-3活性的影響

由圖4可見，高溫組Caspase-3活性極顯著增加，分別為對照組、谷氨酰胺組的4.55倍(P<0.01)、6.53倍(P<0.01)；與對照組相比，谷氨酰胺+高溫處理組在熱恢復6 h奶牛乳腺上皮細胞Caspase-3活性顯著上升(P<0.05)；與高溫組相比，谷氨酰胺+高溫處理組在熱恢復0、6、12 h奶牛乳腺上皮細胞Caspase-3活性分別下降68.04%(P<0.01)、40.89%(P<0.05)、52.06%(P<0.01)。

圖3 谷氨酰胺對高溫應激奶牛乳腺上皮細胞

圖4 谷氨酰胺對高溫應激奶牛乳腺上皮細胞

3 結(jié)論與討論

HSP70是HSP家族中與細胞保護關系最密切的一族，在應激狀態(tài)下可顯著增加，通過免疫機制、調(diào)節(jié)酶活性、影響凋亡相關基因表達等途徑參與細胞凋亡的調(diào)控。HSPs表達量提高賦予機體或細胞抵抗各種應激損傷，尤其是熱耐受能力。Edwards等[6]報道，細胞的耐熱性取決于細胞內(nèi)的HSP70含量。谷氨酰胺是一種極有潛力的HSP誘導劑，可使熱應激[7]、氧化應激[8]、內(nèi)毒素血癥[9]等應激狀態(tài)下的細胞或組織HSP70表達量增高，發(fā)揮其對應激狀態(tài)下細胞或組織的保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞經(jīng)過8 mmol/L的谷氨酰胺誘導24 h后，HSP70表達量顯著增加(P<0.01)，提高了熱應激狀態(tài)下乳腺細胞的熱耐受性和存活力。研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺可誘導體外培養(yǎng)人肺泡Ⅱ型上皮細胞A549細胞HSP70蛋白表達，明顯抑制過氧化氫所致的A549細胞凋亡[10]。補充谷氨酰胺可抑制冷束縛應激狀態(tài)下小鼠小腸黏膜細胞凋亡，從而防治腸屏障功能紊亂及其并發(fā)癥[11]。因此，當細胞或機體接觸非致死性應激反應后，HSP70過表達可保護其免遭應激損傷。

細胞凋亡是一種受基因調(diào)控的自身程序性細胞死亡。Caspase家族是細胞凋亡過程中的關鍵元件，其激活與超常表達均引起細胞凋亡，其中Caspase-3處于凋亡級聯(lián)反應的下游，是多種凋亡信號傳遞的匯聚點[12]。Bcl-2可抑制線粒體釋放細胞色素C，阻礙Apaf-1與效應分子結(jié)合，阻斷細胞凋亡的級聯(lián)反應[13-14]。研究報道，在HSP70保護小腸上皮細胞免受缺氧應激引起的細胞凋亡損傷試驗中發(fā)現(xiàn)，HSP70過表達可通過促進Bcl-2表達，關閉MPTP，阻止細胞色素C釋放至胞漿中，從而抑制缺氧應激引起的小腸上皮細胞凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺預處理促進了奶牛乳腺上皮細胞Bcl-2 mRNA表達，緩解了高溫應激引起的Caspase-3活性上升，保護細胞對抗應激損傷。Bcl-2基因家族是細胞凋亡的重要調(diào)控基因，其中Bcl-2基因具有抗凋亡作用，是細胞生存基因的代表。當Bcl-2表達量上調(diào)時，細胞免遭凋亡。Swanton等[16]研究認為，Bcl-2可抑制線粒體膜的通透性和阻止細胞色素C的釋放，還通過作用于線粒體細胞色素C下游的一個關鍵點而先后抑制Caspase-3和Caspase-2的激活及其Caspase-3依賴的級聯(lián)反應，并使細胞免于發(fā)生凋亡。小腸黏膜細胞Bcl-2的表達部位與細胞的增殖和凋亡部位關系密切，谷氨酰胺缺乏可抑制Bcl-2的合成，加重細胞凋亡，而補充谷氨酰胺可增強其表達，從而抑制細胞凋亡[11]。對Wistar大鼠研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺治療能降低阻塞性黃疸肝細胞凋亡，增加Bcl-2蛋白表達量，降低Bax蛋白表達量[17]。關于谷氨酰胺促進Bcl-2表達的機制尚不清楚，有研究報道，谷氨酰胺能增強細胞膜的穩(wěn)定性[18]。細胞遭受不良應激反應后，Bcl-2基因表達量增加，可能是一種代償性反應，細胞膜結(jié)構(gòu)一旦破壞，Bcl-2蛋白的結(jié)構(gòu)不能得以維持，而給予谷氨酰胺則能減輕細胞的膜結(jié)構(gòu)損壞，促進代償反應的發(fā)生。但其具體的作用機制尚不明確，還有待于進一步探討。

綜上，谷氨酰胺預處理誘導了Bcl-2和HSP70基因的表達，提高了高溫應激奶牛乳腺上皮細胞的熱耐受性和存活力。