陳 波 黃海櫻 周 強(qiáng) 嘉紅云 冀天星 王敏紅 范 平 陳靖楠

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510260)

Laverty在1977年通過電鏡觀察到人乳頭狀瘤病毒(HPV)存在宮頸癌組織里，目前研究表明導(dǎo)致宮頸癌的直接病因是存在HPV感染〔1～3〕。HPV有多種不同基因型(亞型)，已確定亞型有超過120種，其中約40種涉及人類的生殖道感染。不同HPV亞型對宮頸上皮細(xì)胞的侵襲力不同，其中已確認(rèn)HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68等亞型主要是跟宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變有相關(guān)，可視其為高危型。HPV11、16、42、43和44 等亞型與尖銳濕疣等外生殖器良性病變有關(guān)，為低危型〔4〕。高危型HPV的長期持續(xù)感染是宮頸癌變的主要原因，因此，研制開發(fā)針對高危型HPV型特異性基因疫苗是宮頸癌的治療新方向，使該病成為目前唯一的一種病因明確的，又可以治愈和提前預(yù)防的惡性腫瘤。由于HPV亞型的多樣性和不同地區(qū)的感染亞型差別不一，造成針對HPV16和HPV18亞型的疫苗僅能有效保護(hù)約70%患者。世界癌癥組織的多中心研究數(shù)據(jù)顯示，包含7種最常見HPV亞型復(fù)合型的疫苗可以保護(hù)世界上多達(dá)87%的患者〔2～4〕。本研究利用核酸分子快速雜交分型技術(shù)對門診高危人群生殖道HPV感染狀況，進(jìn)行篩查，進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和分析。

1 資料和方法

1.1研究對象 標(biāo)本來源廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2011～2013年婦科門診和體檢中心檢查婦女2 912名。年齡18～81歲，平均(37.50±10.48)歲。

1.2儀器和試劑 凱普公司生產(chǎn)HPV的DNA分離提取試劑盒(細(xì)胞裂解液)。ABI 7700型PCR擴(kuò)增儀由美國ABI公司生產(chǎn)。HPV基因分型檢測試劑盒由凱普公司生產(chǎn)。HybriMax醫(yī)用核酸分子快速雜交儀由凱普公司提供。

1.3標(biāo)本采集和保存處理 按照宮頸細(xì)胞學(xué)取材要求和步驟進(jìn)行HPV篩查標(biāo)本取樣，將宮頸刷放置于宮頸口處，手指輕輕轉(zhuǎn)動宮頸刷5圈，使其順時針方向旋轉(zhuǎn)，慢慢取出宮頸刷，把采集到標(biāo)本放置在已加有專用細(xì)胞保存液的取樣管中，擰緊瓶蓋，立刻送實(shí)驗(yàn)室檢查，或4℃保存待檢(存放2 w)，或-20℃長期保存。

1.4HPV分型檢測步驟 (1)HPV DNA分離提取。(2)HPV PCR擴(kuò)增。(3)核酸分子雜交。(4)顯色(檢測結(jié)果陽性為藍(lán)紫色圓點(diǎn))。(5)結(jié)果讀取。Biotin(酶和顯色對照)和IC(內(nèi)對照)點(diǎn)為陽性，其他點(diǎn)為陰性，判定HPV分型DNA檢測結(jié)果為陰性；Biotin(酶和顯色對照)和IC(內(nèi)對照)點(diǎn)為陽性，其他有一個或多個點(diǎn)為陽性，相應(yīng)判定HPV分型DNA檢測結(jié)果為陽性(單個或多個HPV感染)。試劑盒檢測21種HPV病毒DNA分型，分為高危型和低危型兩類，高危型12種亞型，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、5l、52、56、58和59，低危型5種亞型，包括HPV6、11、42、43和44，中國人常見亞型分別為HPV53和CP8304。

1.5統(tǒng)計方法 使用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及分割檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1HPV感染的年齡分布 按年齡分為18～20、21～25、26～30、31～35、36～40、41～45、46～50、51～55、56～60、61～65和66～81歲11組，HPV篩查人群年齡高峰在36～40歲，其次為31～35歲，66～81歲HPV篩查人群最低，其次為18～20歲。HPV感染率有3個峰值，分別是21～25歲、46～50歲和66～81歲，呈波浪變化。感染人群高峰年齡出現(xiàn)晚，但下降快。各年齡段HPV感染檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.300，P>0.05)。見表1。

表1 各年齡段HPV例數(shù)、陽性數(shù)和陽性率(%)

2.2HPV感染的亞型分布 HPV亞型總陽性率39.22%(1 142/2 912，包括多重感染，重復(fù)計算)，21種亞型均被檢出。感染率最高是HPV16，其次是HPV52、HPV58和CP8304，最低是HPV43，其次是HPV35，見表2。

表2 HPV感染亞型的例數(shù)、陽性數(shù)、陽性率和構(gòu)成比(%)

與HPV43比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與HPV51、56、59、45、42、44和35比較：3)P<0.01；與HPV33、53、18、68、6、31、66和39比較：4)P<0.01；與HPV11比較：5)P<0.01；與CP8304比較：6)P<0.01；與HPV58比較：7)P<0.01

篩查人群HPV感染以高危基因型(12種HPV)為主，占27.85%(811/2 912)，平均2.32%；HPV低?；蛐?5種)占4.19%(122/2 912) 平均0.84%；HPV中國常見基因型(2種)占4.22%(123/2 912)，平均2.11%。

2.3HPV重感染率及其年齡分布 1重感染檢出率20.67%，2重感染5.73%，3重感染1.48%，4重感染比0.45%，5重感染0.07%，6重感染0.03%，多重感染總構(gòu)成比約占30.00%。1重感染的易感年齡為35～45歲，2重感染為25～34歲，3重感染為20～24歲，4重感染20～29歲，5重感染2例分別為34歲和59歲，6重感染1例為65歲，見表3，表4。

表3 HPV重感染率例數(shù)、陽性率和構(gòu)成比(%)

與5重感染和6重感染比較：1)P<0.01；與4重感染比較：2)P<0.01；與3重感染比較：3)P<0.01；與2重感染比較：4)P<0.01

表4 HPV多重感染的年齡頻數(shù)分布(n)

3 討 論

HPV直徑大小為50～55 nm，無包膜、雙鏈DNA、依靠宿主細(xì)胞來進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等過程；HPV侵入人體，其潛伏于易感的基底層細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)一步拷貝、繁殖于子宮頸鱗狀上皮細(xì)胞包體內(nèi)。根據(jù)HPV核酸的同源性差異對其進(jìn)行基因分型，認(rèn)為其相關(guān)序列的同源性在90%～98%內(nèi)是同一個亞型，距今陸續(xù)發(fā)現(xiàn)HPV已有多達(dá)120個亞型〔1～3〕。

全世界范圍內(nèi)每年新增約40萬宮頸癌病例，致使每年有大約20萬婦女死于該疾??；發(fā)病與HPV的感染密切相關(guān)，是造成浸潤性宮頸癌與宮頸上皮內(nèi)瘤變必要的基礎(chǔ)條件〔2〕。低危型引起惡變性較少，跟一些性病濕疣感染有關(guān)；高危型是跟宮頸上皮內(nèi)瘤變有密切關(guān)系，也可因?yàn)椴煌牡乩砦恢眉皩m頸癌的病理類型導(dǎo)致不同HPV亞型感染率差異不同。檢測HPV的不同亞型對宮頸上皮內(nèi)瘤變篩查、評估宮頸細(xì)胞學(xué)改變與進(jìn)展、治療后的監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查和病毒疫苗的研制有重要意義〔5～7〕。

本文結(jié)果與江雪芳等〔8〕報道HPV感染率為26.12%相一致，不同年齡組之間HPV感染率無顯著性差異。本文顯示HPV感染以年輕人為主，與法國報道年輕性活躍婦女HPV感染率最高在17～25歲年齡組相近〔9〕。

本文結(jié)果提示廣州地區(qū)HPV類型是HPV16、52、58和CP8304型。另外，HPV亞型的感染有1重到6重感染類型，與國內(nèi)文獻(xiàn)報道相符〔10〕，而且HPV感染的亞型分布具有種群或地域的特點(diǎn)。