金鑫瑤 朱 征 陳 娜 李 娜 曾文赟 王一婧 姜希娟

(天津中醫(yī)藥大學，天津 300193)

心肌梗死為臨床常見急危重癥，其發(fā)病率有上升趨勢。心肌梗死最主要的病理改變是冠脈狹窄堵塞導致心肌細胞的缺血缺氧甚至壞死。心臟成纖維細胞(CFs)為心肌最主要的細胞成分，其旁分泌作用對于維持心肌細胞微環(huán)境有重要作用。Messina等〔1，2〕研究表明心臟干細胞能自我更新、多能分化，其一旦被激活，可迅速遷移、分化形成心肌和冠脈血管。心肌局部缺血缺氧可激活誘導心臟干細胞遷移〔3〕，而CFs在心肌缺血缺氧時其旁分泌作用可能對于心臟干細胞的遷移有重要影響。補陽還五湯作為臨床常用的治療心肌梗死后氣虛血瘀證的藥物，其具體的作用機制不詳〔4〕。本實驗研究補陽還五湯對缺氧預適應心臟成纖維細胞促心臟干細胞遷移的影響并探討其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 新生1～2 d的昆明小鼠，雌雄不限。

1.2實驗藥物及試劑 補陽還五湯飲片購于天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院國藥堂；8 μm孔徑Transwell小室購自美國Corning公司(3422)；DMEM/F12培養(yǎng)基干粉袋購自美國Gibco公司(12400-024)；兔抗小鼠Vimentin抗體購自武漢博士德生物工程有限公司(PB0378)；結(jié)晶紫購自美國Sigma公司(C3886)；FastLine細胞到cDNA快速制備試劑盒、SYBR Green試劑盒購自北京天根生化科技有限公司(KR105、205-02)；SCF酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、SDF-1 ELISA試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司(SEA120Mu、SEA122Mu)。

1.3細胞培養(yǎng)及鑒定 ①CFS的培養(yǎng)及鑒定：新生的昆明小鼠按文獻〔5〕的方法獲得原代及傳代培養(yǎng)的CFS。實驗時將培養(yǎng)的細胞同步化。取傳代2次后的CFS爬片至蓋玻片上，經(jīng)Vimentin免疫熒光染色鑒定，陽性染色細胞數(shù)達95%以上，符合后續(xù)實驗要求。②心臟干細胞的培養(yǎng)及鑒定：小鼠心臟干細胞，由美國西北大學醫(yī)學院芬伯格心血管研究所覃剛健教授惠贈，培養(yǎng)方法同前。經(jīng)c-kit免疫熒光染色鑒定，陽性染色細胞數(shù)達95%以上，符合實驗要求。

1.4CFS缺氧預適應模型的建立 取生長狀態(tài)良好的第2代細胞，消化后離心，調(diào)整細胞密度為4.8×105/ml，以每孔2.5 ml接種至6孔板中。將細胞培養(yǎng)24 h后置于三氣培養(yǎng)箱(5%CO2+94%N2+1%O2)中缺氧預適應24 h，復制缺氧模型。

1.5補陽還五湯含藥血清的制備及實驗分組 兩組SD大鼠分別用生理鹽水、補陽還五湯(原方劑量根據(jù)徐叔云教授主編的《藥理實驗方法學》等效換算法計算出大鼠生藥量為12.87 g/kg)持續(xù)灌胃1 w。制備出空白胎牛血清(FBS)及補陽還五湯含藥血清，經(jīng)高效液相色譜分析該含藥血清符合實驗要求。將實驗分為對照組(缺氧0 h+10%空白FBS)、模型組(缺氧24 h+10%空白FBS)和補陽還五湯組(缺氧24 h+10%含補陽還五湯的FBS)。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，收集各組成纖維細胞培養(yǎng)液上清及CFS，置于-80℃保存以備后續(xù)實驗使用。

1.6心臟干細胞遷移實驗 無菌條件下打開內(nèi)置8 μm孔徑Transwell小室的24孔板，每個小室內(nèi)加入200 μl含2%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)濕化2 h。每個小室內(nèi)加入100 μl 細胞密度為1×105的心臟干細胞懸液，而24孔板內(nèi)分別加入600 μl各組CFS培養(yǎng)液上清，于37℃培養(yǎng)12 h。取出各組Transwell小室，用棉球小心擦去小室膜上側(cè)細胞，保留膜下側(cè)細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡小室洗滌細胞2次。4%多聚甲醛固定細胞15 min，經(jīng)PBS洗滌2次。再用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗滌3次，風干后200倍鏡下選取5個視野計算心臟干細胞遷移數(shù)，重復實驗3次取其平均值。

1.7RT-PCR法檢測各組CFS中SCF、SDF-1 mRNA的表達 按FastLine細胞到cDNA快速制備試劑盒說明操作，快速制備出經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄的cDNA，經(jīng)微量紫外分光光度計檢測cDNA濃度。以cDNA為模板，按SYBR Green試劑盒說明操作進行PCR擴增。引物由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成，具體引物序列見表1。配成25 μl反應體系：cDNA 1 μl，2×SuperReal premix plus 12.5 μl，上游引物(10 μmol/L)0.75 μl，下游引物(10 μmol/L)0.75 μl，50×Rox reference dye 0.5 μl，ddH2O 9.5 μl。設定PCR反應條件：95℃ 15 min，預變性及熱啟動→95℃ 10 s，變性→60℃ 30 s，退火→40個循環(huán)→72℃充分延伸。實驗數(shù)據(jù)根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法計算出各樣品中目的基因的相對表達量。每組6個樣本，每樣重復3孔，實驗獨立重復3次。

表1 具體引物序列

1.8ELISA檢測各組CFS培養(yǎng)液上清中SCF、SDF-1蛋白旁分泌量 按照說明書嚴格進行操作。設空白孔、標準孔、樣品孔，除空白孔不加外，其余孔依次加入標準品及待測樣品50 μl，立即加入檢測溶液A工作液50 μl，貼覆膜，37℃恒溫箱孵育1 h；棄去液體，洗滌液充分洗滌，加入檢測溶液B工作液100 μl，貼覆膜，37℃溫育30 min；棄液洗滌，再加底物溶液90 μl，貼上覆膜，37℃避光顯色20 min；出現(xiàn)梯度藍色時，加終止溶液50 μl，終止反應，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。在確保酶標板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標儀在450 nm波長下測量各孔光密度(OD)，每組6個復孔，重復實驗3次，取其平均值。

1.9統(tǒng)計學處理 使用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組CFS培養(yǎng)液對心臟干細胞遷移的影響 由圖1發(fā)現(xiàn)：與對照組(29.83±5.98)相比，模型組心臟干細胞遷移數(shù)目明顯增多(41.00±4.73，P<0.05)，提示缺氧24 h可促進心臟干細胞遷移；而補陽還五湯組進一步增加心臟干細胞的遷移數(shù)(50.50±8.02)，較之模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明補陽還五湯具有促心臟干細胞遷移的作用。

2.2各組CFS中SCF、SDF-1 mRNA表達 模型組SCF、SDF-1 mRNA表達水平下調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；而補陽還五湯組上調(diào)SCF、SDF-1 mRNA的表達，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，提示補陽還五湯可能通過上調(diào)缺氧預適應的CFS中SCF、SDF-1 mRNA表達水平進而促進心臟干細胞遷移，見表2。

圖1 結(jié)晶紫染色觀察心臟干細胞遷移情況(×100)

表2 各組培養(yǎng)液上清中SCF、SDF-1 mRNA表達情況

與對照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05，下表同

2.3各組CFS培養(yǎng)液中SCF、SDF-1的蛋白分泌情況 由表3得出，模型組SCF、SDF-1蛋白分泌水平較之對照組下調(diào)，SCF差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，SDF-1蛋白分泌雖有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，補陽還五湯組SCF、SDF-1蛋白分泌水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，提示補陽還五湯可能通過促進缺氧預適應CFS分泌SCF、SDF-1蛋白進而促進心臟干細胞遷移。

表3 各組細胞培養(yǎng)液中SCF、SDF-1蛋白分泌情況

3 討 論

急性心肌梗死歸屬中醫(yī)學“真心痛”、“厥心痛”的范疇，氣虛血瘀為其主要病機。補陽還五湯出自清代王清任之《醫(yī)林改錯》，方由生黃芪120 g，當歸尾6 g、赤芍5 g、地龍3 g、川芎3 g、紅花3 g、桃仁3 g組成，具有補氣活血、祛瘀通絡之功效，故在臨床上也常用于心肌梗死后氣虛血瘀證的治療。

心肌主要由心肌細胞和CFS組成，心肌細胞是心臟的功能單位，而CFS為心肌細胞提供支架作用，維持心肌的結(jié)構(gòu)，同時還參與維持心臟正常的電生理功能〔6〕。而近年來發(fā)現(xiàn)的心臟干細胞具有維持心肌細胞穩(wěn)態(tài)及參與心臟重構(gòu)作用〔7〕，其一旦被激活，可迅速遷移、分化形成心肌和冠脈血管。因此，促進心臟干細胞向梗死區(qū)域遷移至關(guān)重要。有研究表明，當冠脈狹窄或痙攣時，其相應的心肌組織處于缺血缺氧狀態(tài)，可誘導少量心臟干細胞遷移至該區(qū)域，并分化為心肌細胞進而促進受損心肌功能的恢復〔8，9〕。本實驗通過心臟干細胞遷移試驗，發(fā)現(xiàn)缺氧24 h預適應的培養(yǎng)液可增加心臟干細胞遷移數(shù)，驗證了上述研究結(jié)論；而補陽還五湯含藥血清干預后，心臟干細胞遷移數(shù)進一步增多，表明補陽還五湯具有促進心臟干細胞遷移的作用。此外，缺血缺氧可促使心臟成纖維細胞旁分泌一系列遷移相關(guān)細胞因子(如SCF、SDF-1等)，而這可能對于心臟干細胞具有一定的趨化作用〔5〕。SCF可與受體c-kit特異性結(jié)合，對c-kit+心臟干細胞有強烈趨化作用〔10〕，因此SCF/c-kit在參與心肌梗死初始幾個小時內(nèi)的干細胞動員、遷移中發(fā)揮重要作用〔11〕，而這種作用可能是通過活化p38MAPK信號通路實現(xiàn)的〔12〕。SDF-1及其受體CXCR4為促進心臟干細胞遷移的重要因子〔13〕，諸多因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等對心臟干細胞的遷移作用往往依賴于SDF-1/CXCR4軸的調(diào)節(jié)〔14〕。Wang等〔15〕證實SDF-1/CXCR4軸通過激活PI3K/Akt通路介導心肌干細胞遷移，實現(xiàn)修復心肌的作用。本實驗表明補陽還五湯可能通過上調(diào)缺氧預適應CFS中SCF、SDF-1 mRNA表達，增加SCF、SDF-1蛋白分泌，進而促進心臟干細胞遷移。