孫 丹 王淑坤 苗玉娟 盧 強(qiáng) 侯 琛 宋 妍 周風(fēng)華

(濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 濰坊 261053)

目前大腸癌的治療手段主要包括外科手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療及放射治療〔1，2〕，雖然治療手段不斷提高，但是由于治療后的高復(fù)發(fā)率及遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致大腸癌對(duì)人類健康仍然存在嚴(yán)重威脅〔3〕。Wnt基因編碼分泌型糖蛋白，主要通過(guò)與Frizzled(Fzd)受體結(jié)合參與細(xì)胞的增殖、分化及腫瘤生長(zhǎng)等多種生物學(xué)過(guò)程〔4〕。Wnt7a屬于Wnt家族中的經(jīng)典Wnt信號(hào)分子，通過(guò)經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)過(guò)程參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔5〕。本研究從受體與配體結(jié)合的角度，研究Wnt7a及受體Fzd5在大腸癌組織中的表達(dá)變化，探討Wnt7a及受體Fzd5在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1材料 收集濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2015年1月至2016年12月結(jié)腸癌手術(shù)切除標(biāo)本80例，男45例，女35例，年齡26～82(平均62)歲；以癌旁正常組織作為對(duì)照，切取石蠟切片用于HE染色及免疫組化染色。取10例新鮮腫瘤及瘤旁正常組織，放入液氮，用于提取RNA和蛋白，進(jìn)行qRT-PCR及Western印跡檢測(cè)?；颊咝g(shù)前均未接受化療及放療。

1.2主要試劑 小鼠單克隆抗體Wnt7a購(gòu)自Santa Cruz (sc-365459)，兔多克隆抗體Fzd5購(gòu)自Novus biologicals(IMG-71276)。二步法免疫組化試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購(gòu)自北京中山生物試劑有限公司。

1.3免疫組化及判讀標(biāo)準(zhǔn) 主要步驟：切取石蠟切片，厚5 μm，常規(guī)脫蠟入水，過(guò)氧化氫(H2O2)封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波抗原修復(fù)，滴加一抗(Wnt7a及Fzd5濃度均為1∶100)，4℃過(guò)夜，二抗及DAB顯色，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對(duì)照。判讀標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性著色比例和著色強(qiáng)度判定，陽(yáng)性著色比例指陽(yáng)性染色細(xì)胞占5個(gè)以上高倍鏡視野(400倍)同類細(xì)胞的百分比，陽(yáng)性細(xì)胞<5% 為0分，≥5%且<25% 為1分，≥25%且<50%為2分，≥50%且<75%為3分，≥75%為4分;細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：0分為細(xì)胞無(wú)著色，1分為淡黃色，2分為黃色、棕黃色，3分為棕褐色。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相加：0～1分為陰性，2～7分為陽(yáng)性。

1.4qRT-PCR 用Trizol提取組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Wnt7a/Fzd5的PCR體系包括：SYBR Premix (SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ kit，Takara，大連)10 μl，Wnt7a/Fzd5上、下游引物分別為0.5 μl，cDNA 1 μl，去離子水8 μl。以β-actin作為內(nèi)參照，體系配制包括：SYBR Premix 10 μl，β-actin上、下游引物各0.3 μl，去離子水8.4 μl。引物由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物信息見(jiàn)表1。在熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96TM Real-Time System)中進(jìn)行擴(kuò)增。Wnt7a及Fzd5的相對(duì)表達(dá)量通過(guò)檢測(cè)相對(duì)循環(huán)閾值(2-ΔΔCt) 來(lái)獲得。

表1 qRT-PCR引物信息表

1.5Western印跡 提取組織總蛋白，并在酶標(biāo)儀中測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度為2 μg/μl，并將蛋白變性。常規(guī)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離不同分子量的蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，分別孵育一抗Wnt7a及Fzd5(濃度分別為1∶1 000)，4℃過(guò)夜。分別在辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠及抗兔的二抗中孵育，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)進(jìn)行發(fā)光。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Prism5.01軟件(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，Wnt7a及Fzd5之間的相關(guān)性及與大腸癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性采用Spearman分析。

2 結(jié) 果

2.1Wnt7a在大腸癌組織及癌旁正常組織的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，Wnt7a的陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒狀，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。腫瘤組織內(nèi)Wnt7a陽(yáng)性表達(dá)率為82%，明顯高于癌旁正常組織35%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。qRT-PCR及Western印跡結(jié)果顯示，與正常腸黏膜(1.267±0.203，0.250±0.066)相比，腫瘤組織內(nèi)Wnt7a在mRNA(2.574±0.487)及蛋白(0.750±0.250)水平均明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1，圖2。

2.2Fzd5在大腸癌組織及癌旁正常組織的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)zd5的陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒狀，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。腫瘤組織Fzd5的陽(yáng)性表達(dá)率為87%，明顯高于癌旁正常組織的41%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。qRT-PCR及Western印跡結(jié)果顯示，與正常腸黏膜(1.353±0.238，0.412±0.491)相比，腫瘤組織內(nèi)Fzd5 mRNA(2.694±0.463)及蛋白(0.869±0.156)水平均明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 Wnt7a、Fzd5在大腸癌及正常腸黏膜中的表達(dá)(免疫組化，Bar=25 μm)

圖2 Western印跡檢測(cè)Wnt7a、Fzd5在大腸癌及正常腸黏膜中的表達(dá)

2.3大腸癌中Wnt7a及Fzd5的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Wnt7a及Fzd5的表達(dá)與患者的年齡、性別、分化程度無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與腫瘤大小、Duke分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 大腸癌組織中Wnt7a與Fzd5表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4大腸癌中Wnt7a及Fzd5表達(dá)的相關(guān)性 大腸癌組織內(nèi)Wnt7a及Fzd5的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)(r=0.712，P<0.05)。

3 討 論

Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)育及腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔6〕。Wnt信號(hào)的起始為Wnt配體與靶細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合，引起信號(hào)的傳遞，導(dǎo)致靶細(xì)胞發(fā)生一系列生理反應(yīng)或病理變化。Wnt配體通過(guò)與不同受體的結(jié)合介導(dǎo)不同的效應(yīng)過(guò)程〔7，8〕。Fzd受體，由Frizzled基因編碼，屬于7次跨膜蛋白受體家族。Wnt蛋白通過(guò)自分泌或旁分泌的方式與細(xì)胞膜上的Fzd受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，參與正常胚胎發(fā)育和各種疾病過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，多種Wnt信號(hào)分子與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)〔9，10〕。Wnt7a是一種分子量約39 kD的糖蛋白，是Wnt信號(hào)家族中的一員，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔11〕。在乳腺癌，Wnt7a的表達(dá)與結(jié)締組織及患者預(yù)后不良有關(guān)〔12〕；也有研究表明，Wnt7a的活化抑制了肺癌及白血病細(xì)胞的增殖〔11〕；Wnt7a與受體Fzd9的相互作用抑制了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)，促進(jìn)了細(xì)胞的分化〔13〕；有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt7a可能會(huì)促進(jìn)大腸癌發(fā)生發(fā)展，但具體機(jī)制尚未明確。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Wnt7a在大腸癌中的作用可能通過(guò)與受體Fzd5的結(jié)合從而介導(dǎo)Wnt信號(hào)的傳導(dǎo)有關(guān)。Wnt7a的受體可能存在多種，譬如Fzd9、ROR1/2〔13〕等，而Wnt信號(hào)與不同受體的結(jié)合可能會(huì)介導(dǎo)不同的生物學(xué)效應(yīng)。在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中，Wnt7a是否與其他受體結(jié)合及作用將是下一步研究的重點(diǎn)，而Wnt7a與不同受體結(jié)合有可能成為大腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。