張 妍 阮連國 曾友玲 曾 潔

(武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心，湖北 武漢 430032)

皂莢是常用抗癌中草藥之一，臨床可用于乳腺癌、宮頸癌、肝癌等的治療。研究顯示，皂莢提取物濃縮液對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤、前列腺癌、乳腺癌等癌細(xì)胞的生長具有一定的抑制作用〔1，2〕。目前為止，皂莢提取物對(duì)宮頸癌的抑制作用及其機(jī)制國內(nèi)外暫無相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討皂莢提取物對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人宮頸癌Hela細(xì)胞株購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。皂莢提取物由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供，皂莢生藥濃度為2.0 g/ml。Bcl-2單抗、Bax單抗、p53超敏S-P(鼠)試劑盒(Gibco公司)，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Hyclone公司)，TIANampGenmic基因組DNA提取試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)，PCR-ELISA端粒酶試劑盒(福建邁新公司)，EPICSELTE ESP型流式細(xì)胞儀(美國COUITER公司)，LH50A型倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，酶標(biāo)儀器(美國Bio-Rad公司)、TC2323型CO2培養(yǎng)箱(美國SHELDON公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌Hela細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于RPMI1640完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行。

1.2.2MTT法檢測皂莢提取物對(duì)Hela細(xì)胞生長的抑制情況 將傳代的人宮頸癌Hela細(xì)胞調(diào)整濃度為5×104個(gè)/ml，每孔0.2 ml接種于96孔培養(yǎng)板中。隨機(jī)分為對(duì)照組、皂莢提取物0.1、0.5、1.0 mg/ml組，每組6復(fù)孔。對(duì)照組不加藥物，皂莢提取物各組加0.2 ml藥物，培養(yǎng)48 h，加入5 mg/ml MTT貯液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)0.2 ml，振蕩10 min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定各孔吸光度A值，取平均值，利用公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)÷對(duì)照組A值×100%。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率 各組Hela細(xì)胞在相應(yīng)培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h后，收集，1 000 r/min低溫條件下離心5 min，棄上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，加RNaseA，37℃水浴30 min，加磺化丙啶(PI)染色，低溫避光30 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞DNA含量，分析各組宮頸癌Hela細(xì)胞的凋亡率。

1.2.4免疫組化法檢測Bax、Bcl-2、p53蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期宮頸癌Hela細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板，1×105個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為對(duì)照組、皂莢提取物0.1、0.5、1.0 mg/ml組，每組4復(fù)孔。對(duì)照組不加藥物，皂莢提取物各組加0.2 ml藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，爬片，PBS沖洗3次，加4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌2次，按免疫組化試劑盒說明書操作檢測Bax、Bcl-2、p53蛋白表達(dá)情況。胞質(zhì)或胞核染成黃色或棕黃色為陽性反應(yīng)，反之則為陰性。

1.2.5Hela細(xì)胞端粒酶活性檢測 按照端粒酶試劑盒說明書操作方法測定：將生長期宮頸癌Hela細(xì)胞分別于無藥物培養(yǎng)液、皂莢提取物0.1、0.5、1.0 mg/ml培養(yǎng)液中培養(yǎng)，72 h后收集各組細(xì)胞，加入CHARPS裂解液0.2 ml，制成懸浮細(xì)胞。冰浴中包被30 min，以15 000 r/min低溫條件離心15 min，取上清得到含端粒酶的細(xì)胞提取物，置于PCR管中，加入反應(yīng)液，30℃條件下反應(yīng)30 min，然后進(jìn)行PCR(33個(gè)循環(huán)94℃、30 s，55℃、30 s)。使用阻斷稀釋緩沖液2次，加反應(yīng)液5 μl，37℃條件下孵育60 min，PBS沖洗，每孔加入抗二氨基庚二酸(DAP)抗體0.1 ml，包被30 min，PBS沖洗，加四甲基聯(lián)苯胺(TMB)室溫包被5 min，加入0.1 ml終止液，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定各孔吸光度A值，取平均值，計(jì)算端粒酶活性抑制率。端粒酶活性抑制率=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)÷對(duì)照組A值×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1皂莢提取物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響 不同濃度的皂莢提取物對(duì)Hela細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中1.0 mg/ml皂莢提取物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞生長抑制率最高，且有一定的劑量依賴性。見表1。

2.2皂莢提取物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞周期的影響 不同濃度的皂莢提取物對(duì)Hela細(xì)胞周期作用72 h后，與對(duì)照組比較，在G0～G1期百分比升高，S期百分比降低，提示皂莢提取物阻止Hela細(xì)胞從G0～G1期進(jìn)入S期，阻止DNA的無限繁殖，誘發(fā)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡。見表2。

表1 皂莢提取物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與0.1 mg/ml組比較：2)P<0.05；與0.5 mg/ml組比較：3)P<0.05,4)P<0.01；下表同

表2 皂莢提取物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞周期的影響

2.3皂莢提取物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡基因的影響 與對(duì)照組相比，皂莢提取物使宮頸癌HeLa細(xì)胞中p53和Bax表達(dá)顯色加深，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而Bcl-2基因表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著皂莢提取物給藥濃度升高，對(duì)p53和Bax的表達(dá)具有一定的增高趨勢。見表3。

表3 皂莢提取物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡基因表達(dá)陽性率比較

2.4皂莢提取物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞端粒酶活性的抑制 與對(duì)照組相比，不同濃度皂莢提取物組宮頸癌Hela細(xì)胞端粒酶均顯著下降(P<0.05)，表明皂莢提取物可抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞端粒酶活性，其中高濃度組對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞端粒酶活性的抑制具有最顯著的效果(P<0.01)。見表4。

表4 皂莢提取物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞端粒酶活性的抑制

3 討 論

宮頸癌是最常見的一種婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，惡性程度高、死亡率高，且治療后易復(fù)發(fā)，致病因素復(fù)雜，可能是病毒感染、宮頸組織病變、患者免疫功能減弱及社會(huì)環(huán)境因素等綜合作用的結(jié)果〔3～7〕。目前臨床上對(duì)宮頸癌的治療以化學(xué)合成藥物為主，但化療藥物常伴隨產(chǎn)生毒副作用，持續(xù)用藥又容易引起耐藥性。因此，尋找高效低毒天然來源中藥改變宮頸癌的生物學(xué)行為已成為治療宮頸癌藥理學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，皂莢提取物對(duì)乳腺癌、前列腺癌和肝癌等癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用〔8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，皂莢提取物對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，并可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡。

Bax、Bcl-2為同源二聚體，兩者在細(xì)胞內(nèi)的比例變化直接影響細(xì)胞的抑制或促進(jìn)凋亡程度。當(dāng)Bax占優(yōu)勢時(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，反之，Bcl-2占優(yōu)勢時(shí)卻抑制細(xì)胞的凋亡〔9，10〕。而p53主要影響細(xì)胞的修復(fù)及凋亡，對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子具有一定的抑制作用，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)p53會(huì)被立即激活，使細(xì)胞停頓在G1期以便DNA得到修復(fù)，或指示其進(jìn)入凋亡，阻止細(xì)胞持續(xù)分裂和癌變〔11〕。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，皂莢提取物阻止Hela細(xì)胞從G0～G1期進(jìn)入S期，阻止DNA的無限繁殖，誘發(fā)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡。另外，隨著皂莢提取物給藥濃度的升高，p53和Bax的表達(dá)具有一定的升高趨勢。

端粒酶是一種核糖蛋白體酶，在細(xì)胞復(fù)制過程中維持染色體端粒長度的穩(wěn)定。研究顯示，端粒酶活性在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，與調(diào)控細(xì)胞增殖周期密切相關(guān)〔12〕。端粒酶活化是所有惡性腫瘤發(fā)生過程的一個(gè)必經(jīng)之路，癌基因的激活或抑癌基因的失活引起細(xì)胞端粒的丟失與重新組合，導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞無限繁殖下去〔13〕。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，皂莢提取物可抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞端粒酶活性。

本實(shí)驗(yàn)研究提示，皂莢提取物可明顯抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡，抑制Hela細(xì)胞端粒酶的活性，阻止Hela細(xì)胞的無限繁殖。其作用機(jī)制可能是抑制癌細(xì)胞活化的端粒酶，阻止癌細(xì)胞復(fù)制過程中DNA的無限繁殖，同時(shí)增加抑癌基因的活性，使癌細(xì)胞凋亡。