楊 凡 熊學(xué)麗

(荊門(mén)市第二人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 荊門(mén) 448000)

心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，隨著增齡不斷衰老，且數(shù)量不斷減少，在衰老相關(guān)性心血管疾病和心功能下降中，心肌細(xì)胞的衰老發(fā)揮著重要作用。衰老的發(fā)生發(fā)展和線粒體功能障礙、衰老相關(guān)基因的改變、氧化應(yīng)激等關(guān)系密切。老年人群線粒體生物合成和數(shù)量減少，ATP生成下降，線粒體功能障礙。老年人群的衰老基因表達(dá)和活性升高，長(zhǎng)壽基因的表達(dá)和活性下降〔1～4〕。老年人對(duì)活性氧的抑制作用下降，活性氧的生成增加，氧化損傷分子增多。一氧化氮(NO)是心血管活性物質(zhì)，對(duì)心血管發(fā)揮保護(hù)作用〔5〕，非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸(ADMA)是一氧化氮合酶(NOS)的抑制物，抑制NO的生成〔6〕。 本文對(duì)老齡大鼠血清中ADMA水平進(jìn)行研究，并探討其與心肌細(xì)胞衰老的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：選擇12只23月齡、清潔級(jí)、雄性、健康Wistar大鼠作為老年組，12只4月齡、清潔級(jí)、雄性、健康Wistar大鼠作為青年組。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)本采集 將老年組和青年組大鼠麻醉成功后抽取頸動(dòng)脈血離心，留取血清用于血清生化指標(biāo)檢查。處死大鼠，留取心肌組織進(jìn)行RT-PCR測(cè)定。

1.2.2生化指標(biāo) 取離心后血清采用高效液相色譜法測(cè)定ADMA水平；空腹血糖(FPG)采用血糖儀進(jìn)行測(cè)定；血液加入氰化高鐵血紅蛋白測(cè)試液，分光光度計(jì)測(cè)定540 nm處光密度值，以10 g血紅蛋白的吸光度表示糖化血紅蛋白(HbA1c)結(jié)果；血漿胰島素采用競(jìng)爭(zhēng)性放射免疫分析法進(jìn)行測(cè)定；總膽固醇(TC)采用固醇氧化酶-過(guò)氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法進(jìn)行測(cè)定；三酰甘油(TG)采用甘油磷酸氧化酶-過(guò)氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法測(cè)定；低密度脂蛋白(LDL)采用聚乙烯硫酸沉淀法測(cè)定；高密度脂蛋白(HDL)采用磷鎢酸鎂沉淀法測(cè)定。

1.2.3心肌組織中二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)活性、NOS活性和NO含量測(cè)定 心肌組織中DDAH活性采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，取心肌組織上清和ADMA反應(yīng)，以沒(méi)有加ADMA反應(yīng)體系者作為陰性對(duì)照組，DDAH活性值為心肌組織和ADMA反應(yīng)測(cè)得的數(shù)值減去陰性對(duì)照組的數(shù)值。NOS活性按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定，測(cè)量管取心肌組織上清，空白管取雙蒸水，每管加入底物緩沖液反應(yīng)后，測(cè)量530 nm波長(zhǎng)處的光密度值，計(jì)算NOS活性。心肌組織中NO含量采用硝酸還原酶法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4心肌組織中P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA水平測(cè)定 提取心肌組織總RNA，采用RT-PCR法測(cè)定心肌組織中P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA水平，均以GAPDH為內(nèi)參照，P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為目的基因與GAPDH的相對(duì)灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件行t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1老年組和青年組血清ADMA和血糖血脂水平比較 老年組血清ADMA水平明顯高于青年組(P<0.05)，F(xiàn)PG和胰島素水平低于青年組(P<0.05)，血清TC、LDL水平高于青年組(P<0.05)，血清HDL水平低于青年組(P<0.05)；兩組血清TG水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組血清ADMA和血糖、血脂水平比較

2.2兩組心肌組織中DDAH活性、NOS活性和NO含量比較 老年組心肌組織中DDAH活性、NOS活性和NO含量低于青年組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組心肌組織中DDAH活性、NOS活性和NO含量比較

2.3兩組心肌組織中P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA水平比較 老年組心肌組織中P21 mRNA和P53 mRNA水平高于青年組(P<0.05)，Sirt1 mRNA水平低于青年組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組心肌組織中P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA水平比較

2.4老年組血清ADMA水平和心肌組織中P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA水平相關(guān)性 老年組血清ADMA水平與心肌組織中P21 mRNA、P53 mRNA水平呈正相關(guān)(r=0.692，0.681；均P<0.05)，與心肌組織中Sirt1 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.562，P<0.05)。

3 討 論

衰老是生命的基本現(xiàn)象，在分子水平、細(xì)胞水平、組織器官水平、整體水平等各個(gè)層次均有衰老過(guò)程的發(fā)生。細(xì)胞衰老時(shí)，和衰老有關(guān)的蛋白質(zhì)含量和活性發(fā)生變化，如超氧化物歧化酶的表達(dá)和活性下降，β-半乳糖苷酶的表達(dá)和活性升高，都是細(xì)胞衰老的標(biāo)志。衰老也是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素，對(duì)衰老相關(guān)的心血管疾病進(jìn)行研究具有重要意義。NO在衰老相關(guān)的心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義，是一種內(nèi)源性的血管活性物質(zhì)，由eNOS催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，由eNOS合成的NO在心血管系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)血管張力、介導(dǎo)血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張、抑制血小板聚集、抗白細(xì)胞黏附、抗血管平滑肌細(xì)胞增殖等作用，對(duì)心血管具有保護(hù)作用；隨著年齡的增加，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的NO減少，和NO有關(guān)的功能下降〔7〕，其機(jī)制可能和內(nèi)源性L-精氨酸含量下降有關(guān)。ADMA為L(zhǎng)-精氨酸的同系物，是NOS的內(nèi)源性抑制物，ADMA水平升高對(duì)eNOS合成NO具有抑制作用〔8～10〕，從而對(duì)心血管疾病的發(fā)生有促進(jìn)作用；內(nèi)源性ADMA多數(shù)由DDAH代謝為二甲胺和L-胍氨酸，少數(shù)經(jīng)腎臟排出，因此DDAH是ADMA濃度重要的調(diào)節(jié)因子。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老年大鼠血清ADMA水平升高，血糖和胰島素水平降低，存在血脂異常，心肌組織中DDAH活性、NOS活性和NO含量降低，表明ADMA可能通過(guò)抑制NOS合成NO，降低心肌組織中NO含量，并使L-精氨酸之間電子傳遞脫耦聯(lián)。L-精氨酸為NO和NOS合成前體，從而使O2成為受電子體，使超氧陰離子水平升高，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而和心肌細(xì)胞的衰老有關(guān)，增加心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

P21能夠結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶2，從而抑制兩種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶的活性，對(duì)RB蛋白的磷酸化有阻斷作用，使細(xì)胞周期停滯在G1期，從而降低細(xì)胞的增殖能力，誘導(dǎo)細(xì)胞的衰老；P21還能夠抑制增殖細(xì)胞核抗原的活性，增殖細(xì)胞核抗原是DNA多聚酶輔助因子，引起P21能夠抑制S期DNA合成，將細(xì)胞周期阻滯在G1期〔11，12〕。P53為抑癌基因，在靜息狀態(tài)下P53水平很低，在氧化應(yīng)激、DNA損傷、滲透壓休克等各種應(yīng)激時(shí)P53被活化，P53能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯、活化DNA修復(fù)蛋白，從而抑制腫瘤的發(fā)生，在細(xì)胞衰老過(guò)程中，P53蛋白的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性和體外DNA結(jié)合活性增加，可能通過(guò)和DNA結(jié)合誘導(dǎo)P21表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而發(fā)揮阻止細(xì)胞生長(zhǎng)的作用〔13，14〕。Sirt1為長(zhǎng)壽基因，在生物體衰老過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Sirt1通過(guò)對(duì)其他蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白的賴(lài)氨酸殘基進(jìn)行去乙?；瑢?duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，發(fā)揮復(fù)制性衰老，調(diào)節(jié)細(xì)胞壽命等功能〔15，16〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADMA促進(jìn)心肌細(xì)胞衰老的機(jī)制可能和心肌組織中P21 、P53、Sirt1的表達(dá)水平有關(guān)，心肌組織中P21和P53水平升高，使心肌細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞衰老；心肌組織中Sirt1水平降低，使心肌細(xì)胞的壽命減少，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞的衰老。